1. 组织块的质量是否良好？

对于CosMx™ SMI单细胞空间组学数据来说，组织块质量是其中的一个关键变量。制作高质量组织块的两个关键因素是固定和缺血时间。

推荐使用10%的NBF或4%的PFA固定蛋白和RNA组织。由于一次理想的组织固定依赖于固定物在组织中的扩散是否充分，所以推荐的标本厚度为2-3毫米。在这种厚度下，大多数组织类型在室温下需要至少24小时的固定时间（最多72小时）。较厚的组织切片和组织类型，如骨、血或脂肪组织、含有艾滋病毒的组织和某些胎儿组织可能需要较长的固定时间。组织固定不足会导致样品降解和形态保存不良。过度固定也应避免，因为它可能导致非特异性背景染色。标本的最佳固定时间往往需要经过摸索而得出。

缺血时间是指某一特定器官或组织被剥夺足够血液供应，从而失去氧气和营养的时间。虽然在小鼠研究中通常比在人体研究中更容易控制，但缺血是防止组织损伤和RNA降解的关键因素之一。缺血时间越短，RNA质量越好。

通常，我们使用H&E染色来评估组织块的质量。H&E染色可用于确定组织是否正确固定，以及确认组织质量差的区域，例如厚度不一致，撕裂，褶皱和颤动；同时，通过染色图也能从病理上确认目的疾病区域是否存在，是否符合研究需要。当在CosMx™ SMI仪器上运行时，此评估还可用于辅助FOV的选择。

在这里，小编为大家展示几个H&E染色评估组织块质量的例子：

(1)  用中性缓冲福尔马林固定的肾脏石蜡切片。

固定良好的组织，细胞核和细胞质形态良好，收缩最小，基底膜和细胞边缘清晰。

(2) 用中性缓冲福尔马林固定的肾脏石蜡切片。

固定不良的组织，细胞核和细胞质形态较差，细胞边缘过度收缩，界限不清。

(3) 用中性缓冲福尔马林固定的小肠粘膜石蜡切片。

细胞核和细胞质保存良好，但存在一些细胞收缩。

(4) 小肠粘膜石蜡切片，用95%乙醇固定。

虽然核保存良好，但细胞质和细胞外成分大量萎缩。

一些组织处理或切片质量差的例子：

2.  组织切片质量是否良好？

下游试验的成功完成取决于切片和载玻片制备过程中的技术。切片的粘附性和厚度的一致性对下游分析性能有影响。在切片这一环节，SBC空间生物学小分队的伙伴们技术娴熟，经验丰富，若您想要开展单细胞空间组学研究，可以放心地将样本交给我们！

下图展示了高质量和低质量FFPE切片之间的区别。

3. 是否考虑到组织异质性和自体荧光的问题？

如前所述，我们建议在CosMx™ SMI实验正式开始之前用连续切片进行H&E染色。该连续切片既可用于评估组织块质量，也可用于指导FOV圈选。通过恰当的FOV选择，可以避免选择低质量的组织区域，聚焦核心研究区域，并减少仪器的运行时间。

选择组织区域时要考虑科学问题。例如，下图的研究重点是研究癌症、肌肉和正常组织，而不是结缔组织。FOV所在区域是为了回答研究中的科学问题。左图显示了H&E切片，用于指导使用CosMx™ SMI 1K RNA检测运行的FOV的选择。同样覆盖在右边图像上的是每个视场的RNA表达计数。RNA检出随着组织形态变化而变化。在结缔组织、脂肪组织和粘液中通常观察到较低的RNA检出。

尽可能避免将FOV定在组织坏死、剥落、褶皱、皱纹和撕裂处。

组织自身荧光是另一个需要考虑的变量。高的组织自身荧光可能导致更高的背景，并影响细胞分割。在运行期间需要通过选择正确的预漂白来最大限度地减少自身荧光并提高数据质量。

SBC先后搭建GeoMx® DSP和CosMx™ SMI两大空间组学研究平台，并与NanoString携手共建DSP空间组学“卓越中心”，搭配10x Visium Cytassist以及LCM+timsTOF Pro 4D非靶向深度空间蛋白组平台，打造空间生物学全链条创新多组学平台及解决方案，助力科学发现。