碘化丙啶在细胞活性研究PI染色中的应用和常见问题
2024-05-10 来源:本站 点击次数:3185
碘化丙啶（Propidium iodide）是一个小分子芳香化合物，通常在研究和开发中作为荧光核酸结合染料。PI通常用于区分活细胞与凋亡细胞和坏死细胞,因为它可以自由渗透死亡或损伤细胞膜,而不能进入正常活细胞。碘化丙啶能染色核酸，如DNA和RNA，因此可用作流式细胞仪、原位杂交和免疫组织化学应用中细胞膜完整性的指示剂。
在样品中加入碘化丙啶后，细胞膜永久性或可逆性损伤的细胞将发出红色荧光。通过这种方式，碘化丙啶能够快速且可靠地识别和定量死亡和坏死细胞。碘化丙啶有助于确定整体细胞活性，这是用于监测细胞群体对细胞毒性药物或其他环境因素的反应的重要参数。
活力研究通常包括使用碘化丙啶染色，搭配细胞凋亡标记染料（如Annexin V-FITC或发出明亮绿色荧光的iFluor® 488）。当一起使用时，可以获得总细胞计数，并且可以观察样本中的细胞形态。例如，使用这两种染色剂可以区分完整细胞（iFluor® 488-PI-）、早期凋亡细胞（iFluor® 488+PI-）和晚期凋亡或坏死细胞（iFluor® 488+PI+）。
碘化丙啶的化学结构
PI染色方案
用PI染色细胞的基本方法如下:
1. 细胞准备：将PI（碘化丙啶）溶解在PBS或Tris-EDTA缓冲液等缓冲溶液中。染色溶液中PI的浓度可能因实验条件而异，但通常为1-5mg/ml。
2. 细胞培养：细胞从生长表面（例如培养皿）分离，粘附细胞使用胰蛋白酶处理，悬浮细胞使用离心。将多达1X10^6个细胞/100微升分装到聚苯乙烯管中，并在轻轻涡旋的同时加入70%的乙醇。
3. 细胞清洗：向细胞添加2毫升PBS，以300 X g离心5分钟，然后将缓冲液从沉积的细胞中倒出。重复此步骤共2次，以除去残留的培养基或血清成分。
4. 细胞重悬：含有PI的染色溶液（例如，PBS中0.1%的BSA、RNase、PI储备液）应加入到细胞悬液中，以达到所需的PI浓度。轻轻混合细胞和PI溶液以确保均匀染色。
5. 细胞孵育：根据实验的需要，在37摄氏度下孵育细胞一段时间。通常在暗室中用PI孵育细胞超过30分钟，以防止光照导致降解。
6. 分析细胞：孵育后，用PI染色的细胞可以使用流式细胞术进行分析，激光发出的光波长为488nm（蓝绿色）来激发细胞。发出的荧光为红色，波长为617nm。在免疫组织化学（IHC）中，PI常用作核染色剂，用于在组织切片中染色细胞核。
该方案应根据实验要求和优化进行调整。
碘化丙啶的优点及常见问题
使用碘化丙啶染色技术的主要优点是这些方法几乎不会导致细胞损耗，并且可以避免通过水解引起的细胞损伤。然而，使用碘化丙啶也存在一些常见的问题。传统的Annexin V/PI方案以及类似的染色方案可能导致相当数量的假阳性事件（>40%）。这种假阳性与碘化丙啶也会染色细胞质内的RNA有关。这个问题可能出现在初代细胞和细胞系中，最常见于核质比较小的较大细胞。
由于碘化丙啶是一种不可穿透细胞膜的DNA染料，它通常与一种可穿透细胞膜的DNA染料一起用于细菌活性研究中。然而，在研究中，碘化丙啶对生物膜中贴壁细胞的染色已表现出明显低于实际细菌活性的情况，这是由于细胞外核酸（eNA）的存在。观察时，似乎会出现一层假死的红色碘化丙啶染色细胞。这种情况有时会掩盖一部分双重染色的细胞，这些细胞内部是绿色的，表明其活性，而红色层则表明DNA可能位于整个细胞膜之外。
因此，这类细胞群体的活力染色结果使用另一种估计活力的方法进行验证，例如，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或荧光显微镜。在大多数情况下，碘化丙啶的使用限于固定或渗透的细胞，如果遇到活细胞则会被活细胞主动排出的细胞中。在渗透和固定过程中，通常选择使用醇类或醛类试剂。重要的是，醛和醇通常与荧光蛋白和某些表面标记不兼容，因此对苯甲醛可能是更合适的选择。就安全性而言，碘化丙啶是一种疑似致癌物质，可能引起皮肤、眼睛和呼吸系统刺激。
研究了流体剪切力（FSS）对肾小管细胞中凋亡和坏死的影响。HK-2细胞的密集单层在静态条件（FSS 0）或0.5 Pa流体剪切应力（FSS 0.5）下培养48小时。A/细胞先用Annexin-V染色，然后立即通过流式细胞术分析磷脂酰丝氨酸的外翻（Annexin-V荧光，X轴）和碘化丙啶（PI）的摄取（PI荧光，Y轴）。通过Annexin-V-/PI-（左下象限）、Annexin-V+/PI-（右下象限）和Annexin-V+/PI+（右上象限）的标准区分活细胞、早期凋亡细胞或坏死细胞（初级或次级）。B/早期凋亡和坏死细胞的比例进行了量化，结果以细胞总群体的百分比表示。数据表示7次实验的平均值 ± SEM。*HK-2细胞使用Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit根据制造商的指示评估凋亡和坏死。
产 品
表1.Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒选择指南
表2.在死细胞和固定细胞中，用核酸染色标记细胞核
表3.Live or Dead细胞活性检测试剂盒
表4.MycoLight荧光活/死细菌成像试剂盒
在样品中加入碘化丙啶后，细胞膜永久性或可逆性损伤的细胞将发出红色荧光。通过这种方式，碘化丙啶能够快速且可靠地识别和定量死亡和坏死细胞。碘化丙啶有助于确定整体细胞活性，这是用于监测细胞群体对细胞毒性药物或其他环境因素的反应的重要参数。
活力研究通常包括使用碘化丙啶染色，搭配细胞凋亡标记染料（如Annexin V-FITC或发出明亮绿色荧光的iFluor® 488）。当一起使用时，可以获得总细胞计数，并且可以观察样本中的细胞形态。例如，使用这两种染色剂可以区分完整细胞（iFluor® 488-PI-）、早期凋亡细胞（iFluor® 488+PI-）和晚期凋亡或坏死细胞（iFluor® 488+PI+）。
碘化丙啶的化学结构
PI染色方案
用PI染色细胞的基本方法如下:
1. 细胞准备：将PI（碘化丙啶）溶解在PBS或Tris-EDTA缓冲液等缓冲溶液中。染色溶液中PI的浓度可能因实验条件而异，但通常为1-5mg/ml。
2. 细胞培养：细胞从生长表面（例如培养皿）分离，粘附细胞使用胰蛋白酶处理，悬浮细胞使用离心。将多达1X10^6个细胞/100微升分装到聚苯乙烯管中，并在轻轻涡旋的同时加入70%的乙醇。
3. 细胞清洗：向细胞添加2毫升PBS，以300 X g离心5分钟，然后将缓冲液从沉积的细胞中倒出。重复此步骤共2次，以除去残留的培养基或血清成分。
4. 细胞重悬：含有PI的染色溶液（例如，PBS中0.1%的BSA、RNase、PI储备液）应加入到细胞悬液中，以达到所需的PI浓度。轻轻混合细胞和PI溶液以确保均匀染色。
5. 细胞孵育：根据实验的需要，在37摄氏度下孵育细胞一段时间。通常在暗室中用PI孵育细胞超过30分钟，以防止光照导致降解。
6. 分析细胞：孵育后，用PI染色的细胞可以使用流式细胞术进行分析，激光发出的光波长为488nm（蓝绿色）来激发细胞。发出的荧光为红色，波长为617nm。在免疫组织化学（IHC）中，PI常用作核染色剂，用于在组织切片中染色细胞核。
该方案应根据实验要求和优化进行调整。
碘化丙啶的优点及常见问题
使用碘化丙啶染色技术的主要优点是这些方法几乎不会导致细胞损耗，并且可以避免通过水解引起的细胞损伤。然而，使用碘化丙啶也存在一些常见的问题。传统的Annexin V/PI方案以及类似的染色方案可能导致相当数量的假阳性事件（>40%）。这种假阳性与碘化丙啶也会染色细胞质内的RNA有关。这个问题可能出现在初代细胞和细胞系中，最常见于核质比较小的较大细胞。
由于碘化丙啶是一种不可穿透细胞膜的DNA染料，它通常与一种可穿透细胞膜的DNA染料一起用于细菌活性研究中。然而，在研究中，碘化丙啶对生物膜中贴壁细胞的染色已表现出明显低于实际细菌活性的情况，这是由于细胞外核酸（eNA）的存在。观察时，似乎会出现一层假死的红色碘化丙啶染色细胞。这种情况有时会掩盖一部分双重染色的细胞，这些细胞内部是绿色的，表明其活性，而红色层则表明DNA可能位于整个细胞膜之外。
因此，这类细胞群体的活力染色结果使用另一种估计活力的方法进行验证，例如，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或荧光显微镜。在大多数情况下，碘化丙啶的使用限于固定或渗透的细胞，如果遇到活细胞则会被活细胞主动排出的细胞中。在渗透和固定过程中，通常选择使用醇类或醛类试剂。重要的是，醛和醇通常与荧光蛋白和某些表面标记不兼容，因此对苯甲醛可能是更合适的选择。就安全性而言，碘化丙啶是一种疑似致癌物质，可能引起皮肤、眼睛和呼吸系统刺激。
研究了流体剪切力（FSS）对肾小管细胞中凋亡和坏死的影响。HK-2细胞的密集单层在静态条件（FSS 0）或0.5 Pa流体剪切应力（FSS 0.5）下培养48小时。A/细胞先用Annexin-V染色，然后立即通过流式细胞术分析磷脂酰丝氨酸的外翻（Annexin-V荧光，X轴）和碘化丙啶（PI）的摄取（PI荧光，Y轴）。通过Annexin-V-/PI-（左下象限）、Annexin-V+/PI-（右下象限）和Annexin-V+/PI+（右上象限）的标准区分活细胞、早期凋亡细胞或坏死细胞（初级或次级）。B/早期凋亡和坏死细胞的比例进行了量化，结果以细胞总群体的百分比表示。数据表示7次实验的平均值 ± SEM。*HK-2细胞使用Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit根据制造商的指示评估凋亡和坏死。
产 品
表1.Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒选择指南
| 产品名称 | 货号 | Ex/Em | 规格 |
| Cell Meter PE-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒 适用于流式细胞仪 | 22838 | 565/575nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒橙色荧光 405nm激发 | 22830 | 527/550nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 绿色荧光 405nm激发 | 22829 | 410/501nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 蓝色荧光 405nm激发 | 22828 | 406/445nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 深红色荧光 适合流式细胞检测 | 22827 | 656/670nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 红色荧光 适合流式细胞检测 | 22826 | 587/603nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 橙色荧光 适合流式细胞检测 | 22825 | 557/570nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 绿色荧光 适合流式细胞检测 | 22824 | 491/516nm | 100 Tests |
| Cell Meter FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒 适合于流式细胞仪 | 22839 | 491/516nm | 100 Tests |
| Cell Meter APC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒 适合于流式细胞仪 | 22837 | 651/660nm | 100 Tests |
表2.在死细胞和固定细胞中，用核酸染色标记细胞核
| 产品名称 | 货号 | Ex/Em | 规格 |
| 核蓝DCS1死细胞染料 | 17548 | 348/469nm | 0.5mL |
| 死细胞核染料DiTO-15mM DMSO溶液 相当于TOTO-1 | 17575 | 514/531nm | 0.2ml |
| 核绿DCS1死细胞染料 | 17550 | 503/527nm | 0.5mL |
| 核绿DCS1光固定型死细胞核染料 | 17570 | 502/527nm | 1mg |
| 死细胞核染料TWO-PRO1相当于TO-PRO1 | 17571 | 515/531nm | 0.2mL |
| 核橙DCS1死细胞染料 | 17551 | 514/556nm | 0.5mL |
| 碘化丙锭PI | 17516 | 537/618nm | 5g |
| 碘化丙锭PI*10mM水溶液* | 17517 | 537/618nm | 1mL |
| 死细胞核染料DiYO-1 相当于YOYO1*5 mM DMSO Solution | 17580 | 491/508 | 0.2mL |
表3.Live or Dead细胞活性检测试剂盒
| 产品名称 | 货号 | Ex/Em | 规格 | |
| Live or Dead细胞活性检测试剂盒 绿色/红色双荧光 | 22789 | 494/514 537/618 |
200Tests | |
| Live or Dead细胞活性检测试剂盒 绿色/红色双荧光 | 22760 | 494/514 537/618 |
1000Tests | |
| Live or Dead细胞活性检测试剂盒 红/蓝双色荧光 | 22788 | 613/631 348/469 |
200Tests |
表4.MycoLight荧光活/死细菌成像试剂盒
| 产品名称 | 货号 | Ex/Em | Em颜色 | 规格 |
| MycoLight荧光活/死细菌成像试剂盒 | 22411 | 488/530 537/618 |
绿（活） 红（死） |
100Tests |
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