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DNA甲基化测序后的后期验证方法介绍

2024-05-16     来源:本站     点击次数:890

做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。

一、简单验证
  • 目标基因DNA甲基化的验证：Target-BS
  • 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
  • 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）
  • DNA甲基化干扰：
ü  DNA甲基化酶的敲降/敲除/过表达
ü  DNA甲基化抑制剂
阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。
  • 检测整体DNA甲基化变化：
ü  5mC甲基化免疫荧光染色（定性）
ü  DNA斑点杂交（定性）
ü  比色法（定量）
ü  质谱法（定量）
  • 检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
  • 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
  • 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
 
三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证
  • 目的基因DNA甲基化的干扰：
ü  荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基转移酶在体外将质粒进行甲基化，构建含甲基化/未甲基化启动子的目标基因-荧光素酶表达质粒。
ü  CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。
  • 检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
  • 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
  • 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
  • 检测细胞功能受到的影响:
ü  免疫荧光显微观察
ü  功能标志物测定
ü  ... ...
 

CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术
 
目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序）
  • 靶向特定区域进行超高深度甲基化测序。
  • 超高深度：可达几百到几千乘。
  • 单个区域长度<300bp
  • 需要设计BS引物，进行预扩增实验。
  • WGBS vs. TBS相当于RNA-seq vs. RT-qPCR
 



 

典型案例：
Target-BS用于甲基化多位点甲状腺结节诊断

Target-BS发现食管鳞癌甲基化 biomarker

参考文献：
① Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)，DOI 10.1186/s13148-017-0430-7
② Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0841
③ Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns，doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z
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