丙型肝炎病毒探针荧光定量RT-PCR试剂盒使用说明书
2024-07-12 来源:本站 点击次数:274丙 型 肝 炎 病 毒
探 针 法 荧 光 定 量 RT-PCR 试 剂 盒
H e p a t i t i s C V i r u s ( H C V ) P r o b e R T - q P C R K i t
使用手册 V3.0产品及特点
本试剂盒可用于检测丙型肝炎病毒。丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是
一种由丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要经血液传
染，据世界卫生组织统计，全球 HCV 的感染率约为 3%，估计约 1.8 亿人感染了 HCV，
每年新发丙型肝炎病例约 3.5 万例。丙型肝炎可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患
者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，因此快速灵敏诊断具有重要意义。本产品是根据探针
法荧光定量 RT-PCR 原理开发的丙型肝炎病毒检测试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2. 引物等组分经过优化，灵敏度高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据丙型肝炎病毒 RNA 序列高度保守区设计，不会跟其他病
毒的 RNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数
量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。
成分规格
产品组成
编号
规格
2 × OneStep Probe Mix
GZ021101a
550 μl
OneStep Probe Enzyme Mix
GZ021102b
110 μl
DEPC-H2O
GZ070401
1 ml
荧光模板稀释液
GZ070407
1 ml
丙型肝炎病毒 RT-qPCR 引物-探针混合液
GZ1553000yp
160 μl
丙型肝炎病毒 RT-qPCR 阳性对照
(1×10E8 拷贝/μL)
GZ1553000pc
50 μl
保存条件
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。
使用方法
一、RNA 提取(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样
品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光模板稀释液，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，
得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡
1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡
1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用
用自选方法提取纯化样品 RNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。建
议使用病毒基因组 DNA/RNA 提取试剂盒提取 RNA。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
。
若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1×10E5 拷贝/μL 即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
若有 N 个待检样品，准备 N+2 个 qPCR 管(N 个待检样品+1 个阴性对照+6 个阳性对
照)，向各 qPCR 管中分别加入下列成分。
成分
样品管
N+2 个
qPCR
阴性对照
qPCR
阳性对照
2 × OneStep Probe Mix
各 10 μL
10 μL
10 μL
OneStep Probe Enzyme Mix
各 2 μL
2 μL
2 μL
丙型肝炎病毒 RT-qPCR 引物-探针混
合液
各 3 μL
3 μL
3 μL
转移至样本准备区。
四、添加模板(模板添加区)
向 qPCR 管中分别加入 5 μl 模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、丙型肝炎病毒 RT-qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
五、扩增反应(扩增及产物分析区)
将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：
过程
温度
时间
逆转录
50℃
20 min
预变性
95℃
10 min
qPCR 反应
（45 个循环）
95℃
15 sec
60℃
60 sec
信号通道
FAM 通道采集荧光信号
六、结果分析
1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标
准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，推算出其浓
度。
2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲线。
阴性对照结果：Ct 值>40 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。
样本检测结果：Ct 值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出该病毒，结果为阳性；
Ct 值>40 或无 Ct 值，表明样本中未检测出该病毒，结果为阴性；Ct 值在 38-40 范围，应
对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 38-40 范围，有明显指数增长，则判定为阳
性，否则为阴性。
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