RNA 干扰技术是研究基因功能的一种强大工具，这种技术有可能直接从源头上让致病基因“沉默”。今天就让我们一起来学习如何做 RNA 干扰实验！

自发现以来，RNAi 已迅速发展成为一种强大的反向遗传学工具，用于在细胞和生物体水平上研究基因功能、调控和相互作用。在昆虫和其他动物中，已知有三类不同的小 RNA 可触发三条相应的 RNAi 途径：siRNAs、miRNAs 以及 piRNAs。
接下来 为大家介绍 siRNA 干扰途径！


siRNA 是一种小的双链 RNA (dsRNA)，约有 20-25 个核苷酸长度，可以触发 RNA 干扰机制。长双链 RNA 在被 Dcr2 与 R2D2 或 Loqs 切割成短双链 RNA。短双链 RNA 解旋后正义链被降解。

反义链与多种蛋白组分 (如 Ago2) 形成 RNA 诱导的沉默复合体 (RNA Induced Silencing Complex, RISC)。RISC 中保留的反义链与靶基因的 mRNA 特异地互补，同时 RISC 具有核酸酶活性，能将靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表达。

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设计 siRNA

如果您希望设计自己的 siRNA，可根据以下原则来设计 siRNA[3][4][5]。然后，通过化学合成、体外转录、载体或 PCR 产物表达等方式进行制备相应的 siRNA。

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siRNA 套装

为了满足广大研究者利用 RNA干扰的方法去探究基因功能的需求，MedChemExpress (MCE) 专门推出预设计 siRNA 套装。

我们的预设计 siRNA 套装针对靶基因 (仅限人、小鼠、大鼠) 的不同区域设计三对 siRNA，我们保证在标准使用条件下 (转染效率 80% 以上) 至少一对 siRNA 的 mRNA 水平沉默效率达 70% 以上。套装产品包括 3 对 siRNA，附赠阴性对照、阳性对照、FAM 标记阴性对照 siRNA。


 Tips：

• MCE 提供的 siRNA 为冻干粉形式，收到产品后，请于 -20℃ 或 -80℃ 保存，可以稳定保存一年。
• 使用前瞬时离心，用 RNase-free H₂O 或灭菌 ddH₂O 配制成 20 μM 储存液。
• 配置 20 μM 储存液需要向 5 nmol 的 siRNA 中加入 250 μL 灭菌水。
• 20 μM 储存液分装保存避免反复冻融。
• 荧光标记的 siRNA 需要避光保存。

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siRNA 转染

图 4. 检测 siRNA 的转染效率^[6]。 

此外，客户可以通过检测转染了 FAM 标记阴性对照的细胞的荧光信号来确定转染效率 (图 3)。通过转染了 GAPDH 阳性对照的细胞确认转染实验中操作是否有问题。如果 GAPDH mRNA 表达降低，则证明转染实验中操作没有问题，GAPDH siRNA 正常发挥作用。如果 GAPDH mRNA 表达没有变化，则证明操作出现失误，转染失败。

▐ 1. 针对人类基因设计的 siRNA 对其他物种是否也有效？
一般 siRNA 都具有物种特异性，所以针对人类基因设计的 siRNA 沉默其他物种的同源序列的效果无法保证。如果希望 siRNA 能对两个或两个以上的物种有效，这需要进行相应的生物信息学分析。

▐ 2. 同样的 siRNA 为什么在细胞 A 中有效，在细胞 B 效果不好？
不同细胞可能转染效率不一样，基因表达水平也不一样，这些都与 siRNA 的作用效率有关。
▐ 3. 如何设计用于 RT-PCR 的引物？
RT-PCR 的引物应该设计在 siRNA 靶向位点的两侧，而不是同侧。设计于同侧的 PCR 引物可能导致假阴性结果。
另外，RT-PCR 结果会因为靶基因 mRNA 降解时间不同、细胞内靶基因 mRNA 丰度不同而导致假阴性结果，推荐使用多种检测方式包括 RT-PCR、Northern、Western 检测来验证 siRNA 的效果。
▐ 4. 如何改善基因沉默的效果？

• 提高转染效率：首先可依据转染试剂说明书进行转染条件 (细胞密度，转染试剂用量，转染时间等) 优化尝试，其次可尝试在其他细胞类型上进行转染。若由于实验模型限制无法使用其他细胞，可考虑更换转染试剂或转染方法 (如电转)。
• 转染过程中使用无血清培养基：血清会阻碍转染试剂与 siRNA 形成复合物，进而影响转染效果。
• 优化 siRNA 浓度：siRNA 最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异，这取决于 siRNA，细胞系和选择的分析方法。推荐 siRNA 工作浓度为 50 nM，也可以使用不同的浓度进行优化实验以达到最佳转染效率。但过高浓度的 siRNA 可能对细胞产生毒性。
• 调整细胞的生长状态：细胞生长状态不好会影响转染效率。
• 重新设计 siRNA：若确定转染效果尚佳，其他因素也分析没有问题的情况下，却没有达到理想的基因沉默效果，则可以尝试重新设计其他 siRNA。

• 转染试剂浓度过高会产生细胞毒性。
• 转染时的培养基中加入了抗生素，这会降低细胞转染的效率，甚至导致细胞死亡。
• 细胞本身状态不佳。

• 真核基因表达的转录和翻译发生的时间和位置不同。可能 mRNA 的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平。所以一般建议蛋白检测的时间要稍稍推后。
• 某些蛋白表达量到一定的程度之后，足以满足细胞功能。转录出来的部分 mRNA 被降解，并没有参与蛋白翻译的过程。因此，mRNA 水平的下降可能没有引起蛋白水平下降。
• 某些基因有多个转录本，而且有可能每个转录本都会编码产生相应的蛋白。而设计的 siRNA 只是针对其中一个转录本，其他的转录本并未受影响，仍正常表达蛋白。
• 可能涉及到其他更加复杂的机制。

• 动物的体内环境复杂，实验周期长，对 siRNA 产品的稳定性提出了更高的要求。所以一般用于动物实验的 siRNA 需要做化学修饰。
• MCE 的套装中的 siRNA 没有做过化学修饰，不适合用于动物实验。MCE 可以提供不同化学修饰的 siRNA 的定制服务。建议客户选择已经验证过效果的 siRNA 序列进行化学修饰，再用于动物实验。