RNA提取主要用到的试剂以及相关原理介绍
2024-08-06 来源:本站 点击次数:511
RNA提取主要用到的试剂以及相关原理：
Trizol主要成分：苯酚和异硫氰酸胍；原理是裂解细胞，促使核蛋白体解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
氯仿：分子量较大的有机溶剂，可抽提酸性苯酚；氯仿密度大，使有机相和水层分离。RNA提取过程中，苯酚与蛋白结合进入有机相中，使蛋白与RNA脱离，RNA进入水相。在EP管中会出现上层是RNA，中层白色的是DNA，下层是蛋白质。
异丙醇：其-OH为亲水基团，与水更好的结合从而使RNA脱水产生沉淀。
DEPC水：RNA酶抑制剂和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性。
RNA提取步骤：
1. Trizol裂解细胞或组织，充分裂解；
2. 氯仿抽提，每管200ul氯仿，剧烈晃动混匀，冰上静置10min;
3. 12000rpm,4℃离心15min;
4. 小心吸取上清液（一般吸取400ul）至于新的EP管中，可看到溶液分三层，上层澄清透明的是含RNA的水相，中层白色絮状物是DNA，下层粉红色是含蛋白质的有机相。
5. 加入等体积（400ul）的异丙醇进行脱水，上下颠倒10~15次，轻柔的混匀，冰上静置10~30min;
6. 12000rpm,4℃离心10min;
7. 离心后可看见管壁有白色沉淀，如若没有，可重复步骤6，再离心；后弃掉上清液，缓缓倒出上清液，注意不要将沉淀倒出，加入75%乙醇（无水乙醇：DEPC水=3:1）上下颠倒，直至沉淀离开管壁（清洗RNA沉淀）
8. 12000rpm,4℃离心5min;
9. 再次清洗（弃掉上清液，缓缓倒出上清液，注意不要将沉淀倒出，加入75%乙醇，上下颠倒，直至沉淀离开管壁；
10. 12000rpm,4℃离心5min;
11. 弃掉上清液，将EP管倒扣在干净的滤纸上，吸干EP管内残留的液体，保证管内仅剩RNA沉淀；
12. 加入一定量的DEPC水（根据RNA沉淀的大小加，一般10~20ul），瞬离，轻弹EP管，保证沉淀溶于DEPC水中后，再次瞬离，RNA完全溶解后，至于-80℃保存。
Trizol主要成分：苯酚和异硫氰酸胍；原理是裂解细胞，促使核蛋白体解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
氯仿：分子量较大的有机溶剂，可抽提酸性苯酚；氯仿密度大，使有机相和水层分离。RNA提取过程中，苯酚与蛋白结合进入有机相中，使蛋白与RNA脱离，RNA进入水相。在EP管中会出现上层是RNA，中层白色的是DNA，下层是蛋白质。
异丙醇：其-OH为亲水基团，与水更好的结合从而使RNA脱水产生沉淀。
DEPC水：RNA酶抑制剂和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性。
RNA提取步骤：
1. Trizol裂解细胞或组织，充分裂解；
2. 氯仿抽提，每管200ul氯仿，剧烈晃动混匀，冰上静置10min;
3. 12000rpm,4℃离心15min;
4. 小心吸取上清液（一般吸取400ul）至于新的EP管中，可看到溶液分三层，上层澄清透明的是含RNA的水相，中层白色絮状物是DNA，下层粉红色是含蛋白质的有机相。
5. 加入等体积（400ul）的异丙醇进行脱水，上下颠倒10~15次，轻柔的混匀，冰上静置10~30min;
6. 12000rpm,4℃离心10min;
7. 离心后可看见管壁有白色沉淀，如若没有，可重复步骤6，再离心；后弃掉上清液，缓缓倒出上清液，注意不要将沉淀倒出，加入75%乙醇（无水乙醇：DEPC水=3:1）上下颠倒，直至沉淀离开管壁（清洗RNA沉淀）
8. 12000rpm,4℃离心5min;
9. 再次清洗（弃掉上清液，缓缓倒出上清液，注意不要将沉淀倒出，加入75%乙醇，上下颠倒，直至沉淀离开管壁；
10. 12000rpm,4℃离心5min;
11. 弃掉上清液，将EP管倒扣在干净的滤纸上，吸干EP管内残留的液体，保证管内仅剩RNA沉淀；
12. 加入一定量的DEPC水（根据RNA沉淀的大小加，一般10~20ul），瞬离，轻弹EP管，保证沉淀溶于DEPC水中后，再次瞬离，RNA完全溶解后，至于-80℃保存。
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