RNA的提取方法TRIzol法的原理及优缺点
2024-08-21 来源:本站 点击次数:135
RNA抽提有很多种方法，其中TRIzol法是最流行的。
TRIzol作用原理：
TRIzol的主要成分是苯酚、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等。
其中，苯酚的作用是（1）、裂解细胞（2）、变性蛋白；8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇的作用是抑制RNase。
一、TRIzol法的优缺点：
优点：
快速；
能抽提多种属总RNA；
对少量的组织和细胞以及大量的组织和细胞都能有效分离；
能抽提不同分子量大小的多种RNA；
能够避免DNA和蛋白的污染；
抽提出来的RNA适用于多种实验；
另外，样品中基因组DNA比例高，或酶、脂肪含量高，或者习惯使用尽可能多的样品时建议使用该方法，并且该方法可以同时对DNA、RNA和蛋白进行分别提取，在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA，在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原，用乙醇沉淀中间层可回收DNA，用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
缺点：
由于取上清比较复杂，速度慢，且不容易取净，容易丢失较多的RNA，样本量较大或RNA丰度不高的组织提取时不建议使用，且需要使用氯仿、苯酚等有毒试剂。
二、RNA的提取：
1、从液氮中取出组织后，快速的拿到超净台上，放入小皿中，加入trizol试剂，（100mg的组织放入1.2ml的trizol试剂），用注射器进行研磨，注意要熟练，快速研磨。（下面加的试剂按照1ml trizol的比例添加即可）。
2、细胞或组织加入Trizol研磨后，15~30℃孵育15min，使其充分裂解。(此时如果不接着做下面的实验可以冻存于-80℃低温冰箱)。
3、4℃，12000转，离心5min ,弃沉淀。（超净台准备好EP管，离心后，吸取上清至准备好的EP管中）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15s,（用手震荡即可）15~30℃孵育2~3min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。（氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般储存在4℃冰箱中）。
4、4℃，12000转,离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。注：（1）吸取水相要小心，千万不要吸取中间界面。可采用小枪头少量多次吸取（2）若同时提取DNA和蛋白质，则保存下层有机相，存于4℃冰箱内备用，否则弃下层有机相。
5、按500ul异丙醇/ml Trizol 的比例加入异丙醇，用手震荡一下，15~30℃（室温即可）孵育10min。2~8℃，12000g,离心10min,弃上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇／ml Trizol加入75％乙醇，漩涡混匀，悬浮沉淀。（注：75％乙醇用DEPC水配制）。
6、4℃，7500转离心5min，尽量弃尽上清（注：用完离心机关电源后，将离心机盖打开30分钟降温，再盖上）室温晾干或真空干燥5~10min。（注：不能用离心的方法使RNA干燥，RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）
7、1×RNAsafe30 ul（或1‰DEPC水30ul）溶解RNA沉淀,60℃水浴20min（注：用蒸馏水配置1/100的DEPC水高压后才能用,20×RNAsafe 用DEPC水稀释）测OD值定量RNA浓度（用DU800紫外光度计测量）如果提取的RNA不进行逆转录可在-80℃保存。
TRIzol作用原理：
TRIzol的主要成分是苯酚、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等。
其中，苯酚的作用是（1）、裂解细胞（2）、变性蛋白；8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇的作用是抑制RNase。
一、TRIzol法的优缺点：
优点：
快速；
能抽提多种属总RNA；
对少量的组织和细胞以及大量的组织和细胞都能有效分离；
能抽提不同分子量大小的多种RNA；
能够避免DNA和蛋白的污染；
抽提出来的RNA适用于多种实验；
另外，样品中基因组DNA比例高，或酶、脂肪含量高，或者习惯使用尽可能多的样品时建议使用该方法，并且该方法可以同时对DNA、RNA和蛋白进行分别提取，在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA，在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原，用乙醇沉淀中间层可回收DNA，用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
缺点：
由于取上清比较复杂，速度慢，且不容易取净，容易丢失较多的RNA，样本量较大或RNA丰度不高的组织提取时不建议使用，且需要使用氯仿、苯酚等有毒试剂。
二、RNA的提取：
1、从液氮中取出组织后，快速的拿到超净台上，放入小皿中，加入trizol试剂，（100mg的组织放入1.2ml的trizol试剂），用注射器进行研磨，注意要熟练，快速研磨。（下面加的试剂按照1ml trizol的比例添加即可）。
2、细胞或组织加入Trizol研磨后，15~30℃孵育15min，使其充分裂解。(此时如果不接着做下面的实验可以冻存于-80℃低温冰箱)。
3、4℃，12000转，离心5min ,弃沉淀。（超净台准备好EP管，离心后，吸取上清至准备好的EP管中）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15s,（用手震荡即可）15~30℃孵育2~3min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。（氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般储存在4℃冰箱中）。
4、4℃，12000转,离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。注：（1）吸取水相要小心，千万不要吸取中间界面。可采用小枪头少量多次吸取（2）若同时提取DNA和蛋白质，则保存下层有机相，存于4℃冰箱内备用，否则弃下层有机相。
5、按500ul异丙醇/ml Trizol 的比例加入异丙醇，用手震荡一下，15~30℃（室温即可）孵育10min。2~8℃，12000g,离心10min,弃上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇／ml Trizol加入75％乙醇，漩涡混匀，悬浮沉淀。（注：75％乙醇用DEPC水配制）。
6、4℃，7500转离心5min，尽量弃尽上清（注：用完离心机关电源后，将离心机盖打开30分钟降温，再盖上）室温晾干或真空干燥5~10min。（注：不能用离心的方法使RNA干燥，RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）
7、1×RNAsafe30 ul（或1‰DEPC水30ul）溶解RNA沉淀,60℃水浴20min（注：用蒸馏水配置1/100的DEPC水高压后才能用,20×RNAsafe 用DEPC水稀释）测OD值定量RNA浓度（用DU800紫外光度计测量）如果提取的RNA不进行逆转录可在-80℃保存。
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