近年来，小核酸药物研发和临床治疗取得了多项突破性成果，已成为全球投资新风口和生物制药巨头的必争之地，核酸疗法进入快车道。核酸适配体药物作为核酸疗法的重要组成部分，具有许多独特优势，在医药研发领域有着广阔的市场前景。

一、核酸适配体药物介绍

核酸适配体（Aptamer）是指通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）得到的一段长度在20～100 nt左右的单链DNA或RNA序列，可以作为靶向性治疗的分子探针。SELEX技术的初始文库是单链DNA或RNA文库，由1014~1016个随机的长度为20～100个核苷酸序列的寡核苷酸组成，两端为固定引物序列，中间有一个随机区域。初始文库与靶标物质孵育后，结合的寡核苷酸从未结合序列中分离并通过PCR扩增，得到的富集池投入下一轮的筛选，不断循环最终找到高亲和力适配体。(图1）
核酸适配体可折叠形成发卡（hairpin）、假结（pseudoknot) 、凸环（bulge）、G-四聚体（G-quadruplex）等稳定的二级和三级空间结构。核酸适配体的这些空间构型能够与靶标物质通过静电作用、氢键作用、堆积作用、疏水作用和形状匹配等多种相互作用力形成嵌合或包被的高亲和力复合物，从而实现对靶标物质的高度特异性识别结合。（图2）
 
核酸适配体能够识别、结合的靶标物质范围非常广泛，包括金属离子、小分子、氨基酸、多肽、蛋白质、生长因子、细胞粘附分子，甚至是完整的细胞、病毒等。核酸适配体具有与抗体相当的亲和力，其亲和常数可达纳摩尔或皮摩尔水平，因此被称为“化学抗体”。然而同抗体相比核酸适配体具有更大的优势，其中包括具有更好的组织穿透性、更高的热稳定性、更低的免疫原性、更易生产以及可以在不丧失活性的情况下在适配体的天然寡核苷酸骨架中引入各种化学修饰等。表1所示为核酸适配体和抗体的对比情况。

表1  核酸适配体和抗体对比
 

Criteria	Aptamers	Antibody
Basic composition	Nucleotide (four members: A, G, T/U and C)	Amino acid (20 members)
Materials	Nucleic acid (single-stranded DNA or RNA)	• Protein (polymer peptide) •Antibodies consist of two light chains and two heavy chains
Molecular weight and/or size	• 6–30kDa (20–100nt) • ~2nm	• 150–180kDa • ~15nm
Secondary structure	•Hairpin, stem, loop, bulge, G-quadruplex or kissing complex	• α-Helix and β-fold
Binding pattern and/or mechanism of action	• Surface recognition • Three-dimensional interactions via van der Waals forces, hydrogen bonding and electrostatic interactions similar to the way antibodies bind to antigen • Reversal of activity via complementary antidote oligonuclotides	• Binding pocket (key and lock model) • Three-dimensional interaction; antibodies recognize epitopes located on the target antigen
Affinity	•High • Multivalent aptamers can confer increasing affinity and additional functions	•High •Affinity between antibody and antigen depends on the number of identical epitopes on the target antigen
Specificity	•High • The aptamer is able to identify single point mutations and conformational isomers	•High •Antigens may have multiple epitopes, which allow different antibodies to bind to the same antigen
Potential targets	•Wide range: ions, organic and inorganic molecules, nucleic acids, peptides, proteins, toxins, viral particles, whole cells, entire organs and live animals	• Limited to immunogenic molecules •No toxins or other molecules that do not cause strong immune responses
Generation and discovery	• In vitro SELEX (2–15 selection rounds) • ~2–8 weeks •Aptamer can be selected in hours or days via high-throughput automated SELEX	• In vivo biological system • ~6 months or longer
Manufacturing and costs	•Chemical solid-phase synthesis •Controllable and completely in vitro procedure • 2 days for milligrams; 2 weeks for grams •No or low risk of contamination • Facile regulatory affairs and cGMP • Low cost for DNA; high cost for long RNA (>60nt) with special modifications •Costs lowered with the development of new technology	• In vivo (animal-based production) • Potential contamination due to cells or animal-based production • 3 months for 5–20 grams • From mammalian cells: high cost • From transgenic plants or animals: low cost
Batch-to-batch variation	•None or low	• Significant
Physical and thermal stability	•Very stable and long shelf-life • Resistant to high temperature (even up to 95°C) and cycles of denaturation and renaturation •Aptamers can be lyophilized for long-term storage and transport at room temperature	•Unstable and limited shelf-life • Susceptible to temperature (even at room temperature or 37°C) and irreversible denaturation • Requires refrigeration for storage and transport
Chemical modification and conjugation	•Convenient and controllable •Various types available, including sugar, backbone, base and other modifications •Aptamers can be rationally modified without loss of binding affinity	• Restricted and uncontrollable • Limited types and chemical reactions • Stochastic modifications very likely to cause negative consequences, such as loss of activity
Tissue uptake and penetration	• Faster	• Slower
Immunogenicity	•None or low immunogenicity	•High immunogenicity • Increased immune reaction with repeated dosing
Nuclease degradation	•Vulnerable • Limited half-life in vivo (~10min for unmodified version)	• Resistant and not affected by nucleases in vivo
Kidney filtration	• Faster • Short circulation time in vivo (~30min for unconjugated version)	• Slower • Long circulation time (up to 1 month)
Patents and distribution	• Exclusive patents in SELEX technology • Limited initial distribution	• Expired protection or no early patents • More widespread distribution
Development and market	• The development pathway is less explored • Insufficient education and investment (R&D support) •Commercialization has focused on diagnostic-based aptamer products	•Well-developed infrastructure •Abundant support from finance and education • Rapid and sustained increase in drug market share

cGMP, current good manufacturing practice; nt, nucleotide; SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment.

来源：Aptamers as targeted therapeutics: current potential and challenges

凭借其诸多独特的优势，核酸适配体在药物研发领域发展前景广阔。美国 FDA 在 2004年通过了第一个用于治疗年龄相关的黄斑变性的核酸适配体药物哌加他尼钠 ( pegaptanib sodium，商品名为Macugen) ，将核酸适配体药物的研发推向一个新的高度。现已有11种核酸适配体药物进入临床试验阶段（表2），未来必定会有更多的核酸适配体药物被研发出来，并最终用于治疗疾病。

表2  进入临床阶段的核酸适配体药物
 

药物名称	性质	靶标	治疗疾病	临床阶段	时间	研究单位
Pegaptanib	RNA	VEGF	AMD	上市（现已退市）	2004	Eyetech/Pfizer公司
Zimura	RNA	C5	AMD	Ⅰ期	2016	Ophthotech公司
Fovista	DNA	PDGF	AMD	Ⅲ期	2016	Ophthotech公司
AS1411	DNA	核仁蛋白	肾癌	Ⅱ期	2008	Antisoma研究中心
NOX-A12	RNA	CXCL12	CLL	Ⅰ期	2012	NOXXON制药公司
NOX-E36	RNA	CCL2	DN	Ⅰ期	2015	NOXXON制药公司
ARC1779	DNA	VWF	TTP	Ⅱ期	2008	Archemix公司
ARC19499	RNA	TFPI	血友病	Ⅰ期	2010	维也纳医科大学
NU172	DNA	凝血酶	心脏病	Ⅱ期	2013	ARCA生物制药公司
REG1	RNA	FIXa	冠状动脉疾病	Ⅱ期	2007	Regado生物科学公司
NOX-H94	RNA	铁调素	ACI	Ⅱ期	2013	NOXXON制药公司

数据来源：核酸适配体药物的研究进展

二、核酸适配体药物体外代谢研究策略

和传统小分子药物一样，在药物临床前研究阶段，通常需要对Aptamer药物进行体外代谢研究，并提供代谢途径及其产物相关信息。Aptamer药物的代谢酶主要为核酸外切酶和核酸内切酶，广泛分布于血液和各个组织器官，一个合适的体外代谢研究体系，能够最大程度地预测体内的情况，对于Aptamer药物的早期筛选非常重要。表3所示为常用的Aptamer药物体外代谢研究体系。

表3 Aptamer药物的体外代谢研究体系
 

生物基质	试验类型	备注
血清/血浆	代谢稳定性，血浆蛋白结合试验	金属螯合剂抗凝的血浆不适合代谢稳定性研究。
肝S9	代谢稳定性，代谢产物鉴定	肝S9一定程度上可以代替肝组织匀浆使用。
肝微粒体	代谢稳定性	肝微粒体的核酸酶活性较低，可以根据实际情况进行选择。
肝组织匀浆	代谢稳定性，代谢产物鉴定	酶体系比较全面，推荐用于Aptamer药物的体外筛选评价。
肝细胞	代谢稳定性，代谢产物鉴定	肝细胞酶体系最为完善，适用于肝靶向的Aptamer药物研究。
溶酶体	代谢稳定性	溶酶体具有丰富的酶体系，包括核酸酶和各种水解酶等，是研究Aptamer药物代谢稳定性的高效实验体系。

三、IPHASE相关产品

为满足客户对于Aptamer药物体外代谢研究的需求，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，凭借先进的设备，专业的技术人员和多年研发的经验，开发出来多种用于Aptamer药物体外代谢研究的产品，助力广大客户进行Aptamer药物早期筛选研究。
 

类别	分类
亚细胞组分	肝溶酶体
	酸化肝匀浆液
	肝/肠/肾/肺S9
	肝/肠/肾/肺微粒体
	肝/肠/肾/肺胞质液
原代肝细胞	悬浮肝细胞
	贴壁肝细胞
专属血浆	血浆稳定性
	血浆蛋白结合

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参考文献：

[1] Shuanghui Yang, Huan Li, Ling Xu, et al. Oligonucleotide Aptamer-Mediated Precision Therapy of Hematological Malignancies. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2018, 13, 164-165.

[2] Jiehua Zhou, John Rossi. Aptamers as targeted therapeutics: Current potential and challenges. Nat. Rev. Drug Discovery. 2017, 16(3): 181-202.

[3]   靳贵晓，李娟，杨黄浩. 核酸适体的筛选及其在生物医学领域的研究进展[J]．福州大学学报，2016，44(6):920-934.

[4]   刘珊，肖楠，王睿，等. 核酸适配体药物的研究进展[J]．生命科学仪器，2020，18:16-24.

汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。