本期我们重点讲一下MesenPlify^TM无血清无异种成分人类间充质干细胞扩增培养基的使用指南，本篇中主要讲解的是原代MSC分离培养，具体以脐带组织块法分离原代MSC操作为例。

原代MSC分离培养

步骤一 准备材料

● 培养基：新鲜配置的MesenPlify^TM sXF完全培养基（加1%双抗）。

● 培养皿：准备多个15cm皿进行细胞培养。

● 消毒剂：医用消毒酒精（75%）。

● 洗涤液：生理盐水（无菌，加 1%双抗）。

● 工具盒：包括剪刀、镊子、手术刀、移液器、离心管（50mL）等。

● 脐带样本：新鲜的脐带泡在含有1%双抗的PBS里4℃保存运输（最好在获得后尽快处理）。

步骤二 消毒处理

01  吸弃脐带保存液。

02  使用75%的医用消毒酒精完全浸没脐带，浸泡2分钟以确保消毒效果。

步骤三 清洗脐带

01  用无菌生理盐水清洗脐带2-3次，确保彻底去除残留的脐血。

02  每次清洗后均应用无菌的工具保持脐带在无菌环境中。

步骤四 剪切处理

01  将脐带剪成约2-3cm的小段。

02  用无菌生理盐水再清洗2-3次，确保去除残留的脐血。

步骤五 分离华通氏胶

01  沿静脉剪开脐带，尽量去除2条静脉壁与1条动脉壁。

02  轻轻分离华通氏胶，注意避免损伤表皮，使用弯头手术剪将华通氏胶至2-3mm³大小的组织方块，胶质面向下，平铺在150mm细胞培养皿上，每皿10-12片方块。

步骤六 细胞培养

01  由组织块正上方缓慢滴加37℃复温的MesenPlify^TM sXF完全培养基，每个皿滴加15mL左右，注意不要让组织块飘起来。

02  放入37°C、5%CO₂和饱和湿度的培养箱中培养。

步骤七 换液（注意：每2-3天换液一次）

01  每日观察是否有细胞从组织块爬出。

02  换液时，将培养瓶倾斜，同时避免组织块滑动，小心吸弃上清液。

03  慢慢加入37℃复温的MesenPlify^TM sXF完全培养基，滴加培养基的手法与上述相同。

04  将细胞培养皿放回培养箱继续培养。

05  正常换液培养，直到观察到组织块周围有梭形细胞爬出时，使用灭菌后的镊子夹除组织块，此时如果再次换液，MesenPlify^TM sXF完全培养基的用量可改为为18-20mL/皿。

步骤八 传代 （注意：在接种后第 12 天左右 ）

01  观察细胞的生长状况，当细胞汇合度达到约80%时，可进行消化传代。

02  传代时细胞的接种密度为6000/cm²，请依据所需的细胞量，选择合适大小的细胞培养皿。（具体操作步骤可参考下期“hMSCs的传代培养”

注意事项：

所有操作都应在无菌条件下进行，避免任何非无菌材料的接触。

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