第一期的Q&A相信大家对重组蛋白这个小可爱已经有了初步了解，接下来就让我们就其表达体系，使用中的常见问题继续一探究竟吧！！

一、表达体系与选择

（一）重组蛋白表达体系

大肠杆菌表达系统：优点是经济实惠、表达背景清晰、表达快速便捷、产量高、应用范围广泛。然而，缺点也较为明显，容易形成包涵体，且翻译后无法修饰表达，对于大分子蛋白来说，表达相对困难。例如，一些复杂的蛋白质在大肠杆菌中可能无法正确折叠，导致活性降低。

酵母细胞表达系统：具有经济实惠、成本投入低、蛋白表达迅速且产量高的优点，部分蛋白还可以实现翻译后修饰。但缺点是蛋白包含非人源糖基化以及高甘露糖修饰，可能会影响蛋白的功能和活性。

昆虫细胞表达系统：蛋白表达基因容量大，可溶蛋白相对更高，对于用于制备毒性蛋白，可实现翻译后修饰。不过，蛋白表达周期长，需要投入的成本高，而且表达的蛋白缺少部分糖基化。例如，在制备某些复杂的毒性蛋白时，昆虫细胞表达系统虽然能够实现表达，但整个过程可能需要数周甚至数月的时间。

哺乳动物细胞表达系统：蛋白可溶性高，且生产的蛋白内毒素较低，蛋白活性更高而且可实现翻译后修饰。但缺点是蛋白表达周期长而且投入的成本相对较高。一般来说，哺乳动物细胞表达系统的成本可能是其他表达系统的数倍甚至更高。

（二）选择重组蛋白技巧

表达体系：根据实验目的和蛋白特性选择合适的表达体系。如果需要快速获得大量蛋白且对翻译后修饰要求不高，可以选择大肠杆菌表达系统；如果需要一定程度的翻译后修饰且对糖基化要求不那么严格，可以考虑酵母细胞表达系统；对于复杂的蛋白尤其是需要毒性蛋白表达或具有特定翻译后修饰要求的，可以选择昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统。

标签及位置：蛋白标签有助于目的蛋白的表达、纯化、检测和示踪等。常用的标签有 His/6xHis、Flag、GST、C-Myc、HA、GFP、mCherry、C-Fc 等。标签位置会对重组蛋白的结构与特性造成影响，对于较难表达或较容易降解的蛋白，可将融合标签选择在N端以提高稳定性和减小免疫原性；若为分泌蛋白，建议构建在C端，因为在分泌到高尔基体的过程中，N 端的融合标签会随着 N 端信号肽的切除而失去作用。

有无载体蛋白：载体蛋白可提高重组蛋白的稳定性，避免重组蛋白粘附在管壁导致活性下降。常用的载体蛋白有 0.1% BSA、5%人血清白蛋白 HSA、10% FBS、海藻糖等，最常用的是 0.1% BSA。

是否无动物成分：无动物成分重组蛋白在生产过程中不使用任何动物来源的原料和试剂，避免了痕量的动物成分、动物病原体和抗原对实验造成影响。主要应用于可能进入临床试验的重组蛋白药物研究和需要明确培养条件的实验。

内毒素水平：内毒素主要是G -菌细胞壁外表层结构成分，本质是脂多糖LPS。内毒素污染十分危险，可引发动物内毒素休克、炎症或败血症，并对组织培养物有害。大肠杆菌表达系统生产的蛋白具有更高水平的内毒素，在选择重组蛋白产品时，尤其是应用于细胞培养、动物体内实验等领域时，内毒素水平是重要参考要素。

活性：重组蛋白活性分为ED50和比活力两个数据。ED50是能引起50%阳性反应或50% 最大效应的浓度或剂量，一般来说 ED50 值越小，作用越强。比活力是在特定条件下，单位重量蛋白质所具有的酶活力单位数，比活力越大，酶的纯度越高。

纯度：重组蛋白的纯度可通过SDS-PAGE或HPLC鉴定。高纯度的重组蛋白可以减少杂质对实验结果的干扰。

片段形式：由于技术限制、表达效率等问题，重组蛋白使用片段形式可能更易于纯化和表达，提高溶解性和稳定性。

二、溶解注意事项

（一）开盖前离心处理

细胞因子重组蛋白通常以冻干粉的形式保存，在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上。因此，在开盖前进行离心处理至关重要。通过离心处理，可以确保蛋白粉末集中在管底，以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解，从而避免因蛋白分散而影响溶解效果。

（二）正确选择溶解液

不同的重组蛋白需要用特定的溶液溶解，这是由蛋白质的性质决定的。我们知道，蛋白的溶解性与很多因素有关，其中比较重要的是pH值和离子强度。例如，重组人IL-5需用水溶解，而重组人IL-2则需用 100mM Acetic Acid（醋酸）溶解，重组人TGF-beta1 需用 10mM Citric Acid（柠檬酸），pH3.0 溶解。对于重组细胞因子冻干粉来说，即使是同一个分子的蛋白，不同批次间的溶解方法也可能会有所不同，因此具体应该如何溶解应以相应批次的说明书为准。

（三）溶解浓度要求

重组蛋白应溶解到指定浓度范围，这对于保持蛋白的稳定性至关重要。蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性，这个范围就是说明书上所标明的浓度范围。如重组人 FGF-6为0.5 - 1.0mg/ml，而重组人Activin B则一定要是0.5mg/ml。如果高于或低于这个浓度范围，就可能会使细胞因子的活性下降。如果高于这个浓度范围，就有可能会超过该因子的最大溶解度，使其无法完全溶解。还有就是高于或低于这个范围，可能会出现蛋白质聚集现象，同样会使部分蛋白质不溶解，导致蛋白质活性下降。

（四）避免振荡溶解

不能用涡旋仪振荡溶解重组蛋白，因为对于细胞因子重组蛋白来说，只有具有一定的空间结构才可能使其活性。在冻干粉溶解过程中，用涡旋振荡器进行 vortex 会破坏蛋白的空间结构，从而影响蛋白的活性。

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