脯氨酸（PRO）含量测定试剂盒实验微量法测定指南
2024-11-22 来源:本站 点击次数:171
测定意义：
Pro广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。
测定原理：
用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。
测定步骤：
(2) 待冷却后，加入0.5mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.2mL上层溶液于微量石英比色皿或96孔板中，于520nm波长处比色，记录吸光值A。
Pro含量计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、典型回归方程y = 0.0521x - 0.0021 (x为脯氨酸含量，μg/mL；y为吸光值A)
2、按照血清（浆）体积计算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)
3、按照蛋白浓度计算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照样本质量计算
Pro含量(µg/g鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W
5、按照细菌或细胞密度计算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)
V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、典型回归方程y = 0.02605x - 0.0021 (x为脯氨酸含量，μg/mL；y为吸光值A)
2、按照血清（浆）体积计算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)
3、按照蛋白浓度计算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照样本质量计算
Pro含量(µg/g鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W
3、按照细菌或细胞密度计算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)
V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意：最低检测限为1μg/mL或1μg /g鲜重 或0.01μg /mg prot
Pro广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。
测定原理：
用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。
测定步骤：
- 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。
- 样本测定：
(2) 待冷却后，加入0.5mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.2mL上层溶液于微量石英比色皿或96孔板中，于520nm波长处比色，记录吸光值A。
Pro含量计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、典型回归方程y = 0.0521x - 0.0021 (x为脯氨酸含量，μg/mL；y为吸光值A)
2、按照血清（浆）体积计算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)
3、按照蛋白浓度计算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照样本质量计算
Pro含量(µg/g鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W
5、按照细菌或细胞密度计算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)
V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、典型回归方程y = 0.02605x - 0.0021 (x为脯氨酸含量，μg/mL；y为吸光值A)
2、按照血清（浆）体积计算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)
3、按照蛋白浓度计算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照样本质量计算
Pro含量(µg/g鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W
3、按照细菌或细胞密度计算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)
V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意：最低检测限为1μg/mL或1μg /g鲜重 或0.01μg /mg prot
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