核酸杂交在食品微生物检验中的应用探微
2024-11-23 来源:威尼德生物科技 点击次数:246
一、引言
二、核酸杂交原理
三、核酸杂交技术分类
（一）固相杂交
（一）食源性致病菌检测
（一）优势
（一）固相杂交
- 斑点杂交（Dot Blot Hybridization）
- 实验步骤：首先将提取的食品样品中的核酸固定在固相支持物（如硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，通常采用点样的方式，使核酸形成一个个斑点。然后将标记有放射性同位素（如 ³²P）或非放射性标记物（如地高辛、生物素等）的核酸探针与膜上的核酸进行杂交。杂交后，通过检测标记物的信号来判断是否存在杂交反应。例如，若使用放射性同位素标记的探针，可通过放射自显影技术检测杂交斑点；若为非放射性标记，则可利用相应的免疫检测或化学显色反应进行检测。
- 应用实例：在检测食品中的大肠杆菌 O157:H7 时，可以提取食品样品中的总核酸，点样于硝酸纤维素膜上，用特异性针对大肠杆菌 O157:H7 的核酸探针进行斑点杂交。若样品中含有该菌，探针与靶核酸杂交后，通过检测标记物信号即可确定其存在。
- Southern 杂交（Southern Blot Hybridization）
- 实验步骤：先对食品样品中的 DNA 进行限制性内切酶消化，将消化后的 DNA 片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后将凝胶中的 DNA 片段转移到固相支持物（如尼龙膜）上。接着，与标记的核酸探针进行杂交。杂交后，通过检测标记物的信号确定与探针互补的 DNA 片段的大小和位置。
- 应用实例：在检测食品中特定基因工程微生物时，可利用 Southern 杂交确定转入微生物基因组中的外源基因的存在、数量和整合位置。例如，对于转基因大豆制品中转入的特定抗虫基因，可提取大豆基因组 DNA，经酶切、电泳、转移后，用抗虫基因的特异性探针进行杂交检测。
- Northern 杂交（Northern Blot Hybridization）
- 实验步骤：与 Southern 杂交类似，但检测的对象是 RNA。首先提取食品样品中的总 RNA，经电泳分离后转移到固相支持物上，再与标记的核酸探针杂交，通过检测标记物信号确定特定 RNA 分子的表达水平和大小。
- 应用实例：在研究食品发酵过程中微生物基因表达调控时，可采用 Northern 杂交检测发酵微生物在不同发酵阶段特定基因转录产物（mRNA）的量的变化，从而了解发酵过程中微生物代谢途径相关基因的表达规律。
（一）食源性致病菌检测
- 沙门氏菌检测
- 实验步骤：首先采集食品样品（如肉类、蛋类等），采用适当的方法提取其中的微生物核酸。设计针对沙门氏菌特异性基因（如 invA 基因）的核酸探针，可采用化学合成法制备探针，并标记上合适的标记物（如地高辛）。将提取的核酸与标记探针在适宜的杂交缓冲液中进行杂交反应，杂交条件可设置为 50°C 左右，杂交时间 1 - 2 小时。杂交后，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测杂交信号，即先将杂交体与包被在微孔板上的抗地高辛抗体结合，再加入酶标二抗和底物进行显色反应，根据颜色深浅判断是否存在沙门氏菌核酸杂交体，从而确定样品中是否有沙门氏菌污染。
- 应用效果：与传统的培养法相比，核酸杂交法检测沙门氏菌的时间可缩短至 1 - 2 天，而传统培养法通常需要 3 - 5 天甚至更长时间。并且核酸杂交法的灵敏度更高，能够检测到更低浓度的沙门氏菌，可检测限可达到 10³CFU/g 以下，有效提高了对低污染水平沙门氏菌的检测能力。
- 金黄色葡萄球菌检测
- 实验步骤：对于食品样品（如乳制品、糕点等）中的金黄色葡萄球菌检测，先进行增菌培养以富集目标菌，然后提取核酸。设计针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc 基因）的探针，用生物素标记。将提取的核酸与标记探针在杂交管中进行杂交，杂交温度约 45°C，时间约 90 分钟。杂交后，利用亲和素 - 酶结合物与生物素标记的杂交体结合，加入底物后通过比色法检测杂交信号。
- 应用效果：核酸杂交检测金黄色葡萄球菌能够避免传统生化鉴定方法中因菌株表型变异导致的误判。其特异性可达 95% 以上，灵敏度可检测到 10² - 10³CFU/g 的金黄色葡萄球菌，有助于更准确地监测食品中金黄色葡萄球菌的污染情况，尤其是在低浓度污染时能及时发现问题，保障食品安全。
- 假单胞菌检测
- 实验步骤：在检测食品（如新鲜蔬菜、肉类等冷藏食品）中的假单胞菌时，从食品样品中提取总核酸。针对假单胞菌的特定基因序列（如 16S rRNA 基因片段）设计核酸探针，采用放射性同位素 ³²P 标记。将提取的核酸与标记探针在杂交袋中进行杂交，杂交温度控制在 48°C 左右，杂交时间 1.5 小时。杂交后，通过放射自显影技术检测杂交信号，若出现杂交条带则表明样品中有假单胞菌存在。
- 应用效果：传统的平板计数法检测假单胞菌需要较长时间的培养（2 - 3 天），且难以区分活细胞和死细胞。而核酸杂交法可直接检测核酸，不受细胞死活状态影响，能在 1 - 2 天内快速检测出假单胞菌，并且可以对假单胞菌的种类进行初步鉴定，有助于及时采取措施防止食品腐败变质。
- 酵母和霉菌检测
- 实验步骤：对于食品（如水果制品、面包等）中的酵母和霉菌检测，先提取样品中的核酸。设计针对酵母和霉菌保守基因序列（如 ITS 区域）的核酸探针，可采用荧光素标记。将提取的核酸与标记探针在微量离心管中进行液相杂交，杂交温度 52°C，时间 1 小时。杂交后，利用荧光检测仪检测杂交体的荧光信号，根据荧光强度判断酵母和霉菌的存在和相对含量。
- 应用效果：核酸杂交法检测酵母和霉菌比传统的形态学鉴定方法更灵敏，能够检测到更低数量的酵母和霉菌细胞，可检测限可达到 10²CFU/g 左右。而且可以在不进行培养的情况下直接检测，大大缩短了检测时间，对于控制食品发酵过程中的微生物群落以及防止食品腐败具有重要意义。
- 双歧杆菌检测
- 实验步骤：在检测酸奶等发酵乳制品中的双歧杆菌时，提取样品中的微生物核酸。设计针对双歧杆菌特异性 16S rRNA 基因序列的核酸探针，用地高辛标记。将提取的核酸与标记探针在杂交微孔板中进行杂交，杂交条件为 55°C，杂交时间 1.2 小时。杂交后，通过酶联免疫反应检测杂交信号，先加入抗地高辛抗体，再加入酶标二抗和底物显色，根据颜色变化判断双歧杆菌的存在和数量。
- 应用效果：传统的平板计数法检测双歧杆菌需要进行选择性培养，操作繁琐且容易受到其他微生物的干扰。核酸杂交法能够特异性地检测双歧杆菌，不受其他乳酸菌等微生物的影响，检测结果更准确。其灵敏度可满足对发酵乳制品中双歧杆菌含量检测的要求，有助于评估发酵乳制品的品质和保健功能。
- 嗜酸乳杆菌检测
- 实验步骤：从食品样品（如发酵蔬菜、酸奶等）中提取核酸，针对嗜酸乳杆菌的特定基因（如 S 层蛋白基因）设计核酸探针，采用生物素标记。将提取的核酸与标记探针在杂交管中进行杂交，杂交温度 46°C，杂交时间 1.3 小时。杂交后，利用亲和素 - 酶结合物与生物素标记的杂交体结合，加入底物后通过比色法检测杂交信号，确定嗜酸乳杆菌的存在和数量。
- 应用效果：核酸杂交检测嗜酸乳杆菌能够快速、准确地确定其在食品中的含量，为益生菌产品的质量控制提供了可靠的检测手段。与传统检测方法相比，可减少检测时间约 1 - 2 天，且对嗜酸乳杆菌的特异性识别能力更强，能够有效区分不同的乳酸菌菌株，保障益生菌产品的质量和功效。
（一）优势
- 高特异性：核酸杂交基于核酸分子的碱基互补配对原理，能够特异性地识别目标微生物的核酸序列，有效避免了传统检测方法中因微生物表型相似而导致的误判。例如，在检测沙门氏菌时，核酸杂交探针可以准确地与沙门氏菌的特定基因序列杂交，而不会与其他非沙门氏菌微生物发生反应。
- 高灵敏度：该技术能够检测到低浓度的微生物核酸，可检测限通常可达到 10² - 10³CFU/g 甚至更低，对于早期发现食品中的微生物污染具有重要意义。如在检测金黄色葡萄球菌时，即使食品中存在少量的该菌，核酸杂交法也能检测出来，而传统培养法可能需要更长时间或更高浓度的菌才能检测到。
- 快速检测：相比传统的培养法和生化鉴定法，核酸杂交法可大大缩短检测时间，一般可在 1 - 2 天内完成检测，有些情况下甚至几个小时即可得到结果。这对于需要快速判断食品微生物安全性的情况（如食品生产线上的质量控制、食物中毒事件的快速诊断等）非常有利。
- 对样品要求较高：核酸杂交需要高质量的核酸样本，如果食品样品中存在杂质（如蛋白质、多糖等）较多，可能会影响核酸提取的纯度和质量，进而影响杂交效果。例如，在检测富含蛋白质的肉类样品中的微生物时，需要采用有效的蛋白质去除方法，否则可能导致假阴性结果。
- 检测成本较高：核酸杂交技术涉及到核酸探针的合成、标记以及一些特殊的检测设备（如荧光检测仪、放射自显影设备等），使得检测成本相对较高。这在一定程度上限制了该技术在一些小型食品企业或基层检测机构的广泛应用。
- 难以区分活细胞和死细胞：由于核酸杂交检测的是微生物的核酸，无论是活细胞还是死细胞的核酸都可能与探针杂交，因此无法直接区分目标微生物的存活状态。在某些情况下，如评估食品的卫生安全性时，了解微生物的存活状态是非常重要的，这就需要结合其他检测方法（如荧光原位杂交结合活细胞染色技术）来解决。
- 新型探针的开发：研究人员将致力于开发更具特异性、灵敏度更高且成本更低的新型核酸探针。例如，利用纳米材料标记的核酸探针，不仅可以提高检测信号的强度，还可能降低探针的合成成本。同时，多靶点核酸探针的设计也将受到更多关注，通过一个探针同时检测多个目标微生物或多个基因序列，提高检测效率。
- 与其他技术的联用：核酸杂交技术与其他检测技术（如 PCR 技术、微流控技术、生物传感器技术等）的联用将成为未来发展的重要趋势。例如，PCR - 核酸杂交技术，先利用 PCR 技术对目标微生物核酸进行扩增，提高核酸浓度，然后再进行核酸杂交检测，可进一步提高检测的灵敏度和特异性；微流控芯片与核酸杂交技术结合，可以实现对多个样品的同时快速检测，提高检测通量，满足大规模食品微生物检测的需求。
- 自动化检测设备的研发：开发自动化程度高、操作简便的核酸杂交检测设备，减少人工操作误差，提高检测结果的准确性和重复性。这些设备将能够集成核酸提取、杂交反应、信号检测和数据分析等多个步骤，使整个检测过程更加高效、便捷，有望在食品生产企业的质量控制和食品安全监管部门的日常监测中得到更广泛的应用。
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