导读
非小细胞肺癌（NSCLC）是全球范围内发病率和死亡率最高的癌症之一，表皮生长因子受体（EGFR）是NSCLC进展重要的驱动基因，其突变状态与患者疗效和预后监测评估密切相关。准确、快速地检测EGFR突变对于NSCLC的精准治疗至关重要。传统的检测方法如Sanger测序、ARMS-PCR、NGS等存在灵敏度不足、通量较低或患者负担较重等局限性问题。

Stilla Technologies研究人员在Lung Cancer Methods and Protocols这本书中编写了题为“6-Color Crystal Digital PCR™ for the High-Plex Detection of EGFR Mutations in Non-Small Cell Lung Cancer ”的文章。详细介绍新型的高阶多重数字PCR技术用于高通量检测非小细胞肺癌（NSCLC）中的EGFR基因突变，描述了实验流程、材料、方法和结果，展示了多重数字PCR系统在快速获得大量突变信息方面的优势，凸显了其在肿瘤基因分型和液体活检监测中的潜力。

 研究亮点：
本研究采用了先进的6-Color Crystal Digital PCR™技术，实现了EGFR突变的高通量、高灵敏度和高阶多重检测。与传统技术相比，在检测精度和多重突变分析能力方面展现出显著优势，能够同时精准定量检测19种EGFR突变，极大提高了检测的可靠性和效率，为临床的决策提供更有效的数据。

 研究结果：
作者优化的高阶多重检测方案（见下图）能够单孔内同时检测五种药物敏感突变（p.L858R，p.L861Q，p.G719S，p.G719A，p.G719C），12种不同的19号外显子插入缺失变异，以及两种耐药突变（p.T790M和p.C797S），检测样本适用于NSCLC患者的肿瘤组织和cfDNA (cell-free DNA)。

▲EGFR 6-Color Crystal Digital PCR™检测中引物和探针的基因组定位以及扩增子的大小。该6色EGFR检测试剂包括七个探针，分别针对G719A/C/S、L858R和L861Q敏感性突变以及T790M和C797S耐药突变。EGFR 19号外显子插入缺失变异具有可变的基因组序列，采用了drop-off检测方法。该方法包括一个参考探针，该探针与突变型和野生型等位基因均具有互补性；以及一个drop-off探针，该探针跨越突变位点，但仅与野生型序列互补。在存在野生型等位基因的情况下，两个探针与其靶标杂交，产生双阳性信号。然而，在存在突变型等位基因的情况下，只有参考探针而非drop-off探针会与其靶标退火，产生单阳性信号。关于drop-off检测的更多细节，请参见：https://www.stillatechnologies.com/application-notes/。

作者对9种DNA标准品进行梯度稀释，每种DNA携带一种EGFR突变，背景为WT DNA。通过对该高阶多重检测方案进行测试，检测到突变频率在2.5%到0.1%之间时，均具有极好的线性关系（见下图）。

▲EGFR 6-Color Crystal Digital PCR™检测的性能。在每25μL反应中含有104拷贝野生型DNA和400拷贝内部阳性对照DNA的背景下，对突变型DNA进行2.5%到0.1%的系列稀释，每个反应拷贝数的理论和检测值之间进行线性回归，得到的R²范围为0.9917到1。

每个荧光通道阴阳性微滴的荧光阈值设置如下图所示。设置阈值时，应将阳性和阴性对照的点图与样本的点图一起合并分析。确保在阈值设置后，阳性对照中的阳性微滴可以被正确统计。

▲使用FAM通道（x轴）进行阈值设置：（A）野生型DNA和外显子19缺失（ATTOTM700通道），（B）L858R、L861Q和G719X突变（Cy®5通道），（C）T790M突变（YY®通道），（D）C797S突变（ROX通道），以及（E）内参（Cy®3通道）。

结论：
6-Color Crystal Digital PCR™技术为非小细胞肺癌患者EGFR突变的检测提供了一个高效、精准和经济性的解决方案。其高灵敏度、多重检测能力和定值准确性，为临床提供了更可靠的诊断工具，也为患者个性化治疗策略的制定提供了坚实的数据支持。随着技术的进一步优化和推广，高阶多重数字PCR有望成为肿瘤分子诊断领域的重要工具，推动精准医学在癌症治疗中的应用，帮助医生更好地实现对患者的全病程管理，为他们制定个性化的治疗方案。

参考文献：
Madic, Jordan, et al. "6-Color Crystal Digital PCR™ for the High-Plex Detection of EGFR Mutations in Non-Small Cell Lung Cancer." Lung Cancer: Methods and Protocols, edited by Pedro G. Santiago-Cardona, vol. 2279, Methods in Molecular Biology, Springer Science+Business Media, 2021, pp. 127-144. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1278-1_10

实体瘤突变检测可用于患者全病程管理（基因分型、靶向药检测、疗效和预后评估、复发监测），艾普拜生物已开发测试针对多种样本类型（体液、新鲜冰冻组织、FFPE）的常见突变数字PCR检测试剂盒，详情见下表。