ELISA试验夹心、间接及竞争测定法的操作过程
2025-01-07 来源:本站 点击次数:264
ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种免疫测定方法，通常用于量化样品中特定目标的水平。常规用于ELISAs的样本包括血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液和尿液。酶联免疫吸附试验通常在96孔微孔板中进行，微孔板上涂有对相关分析物的特异性捕获抗体。在与实验样品、标准品或对照品孵化时，目标分析物被该抗体捕获，一个共轭的检测抗体与目标分析物上的不同表位结合。随后加入底物溶液，产生一个与分析物结合量成比例的信号。ELISA的三个主要方法是夹心法、间接法、和竞争法，每种类型的ELISA都有自己的优势和劣势。
操作过程如下：
1 、夹心法：
原理：针对抗原分子上2个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物。
夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为:
a. 将具有专一性的抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
b. 加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
c. 洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结
d. 洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结
e. 洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果
2、间接法
原理：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。
间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为：
a. 将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。
c. 洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。
d. 洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。
3、竞争法
原理：将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。
竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：
a. 将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
b. 加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
c. 加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。
d. 洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。
e. 当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
操作过程如下：
1 、夹心法：
原理：针对抗原分子上2个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物。
夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为:
a. 将具有专一性的抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
b. 加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
c. 洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结
d. 洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结
e. 洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果
2、间接法
原理：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。
间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为：
a. 将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。
c. 洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。
d. 洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。
3、竞争法
原理：将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。
竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：
a. 将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
b. 加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
c. 加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。
d. 洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。
e. 当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
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