磷酸化蛋白作为细胞信号转导的关键调控者，其研究对揭示生命奥秘和疾病机制至关重要。然而，磷酸化蛋白的低丰度和动态变化特性，WB显影成像时常常会碰到以下问题：

• 条带微弱
• 无条带
• 高背景、杂带多等 

本文整理了磷酸化蛋白Western Blot 实验的优化建议，以帮助研究人员提升实验成功率。 

什么是磷酸化蛋白？
磷酸化蛋白是指蛋白质在激酶催化下发生磷酸化修饰的一类蛋白质。这种修饰如同一个“开关”，调控着蛋白质的活性、定位和相互作用，进而影响细胞增殖、分化、代谢等几乎所有生命活动。

磷酸化蛋白的研究意义？
磷酸化蛋白的研究广泛，涉及以下领域：
* 细胞信号通路：研究细胞如何通过磷酸化响应外界刺激。
* 疾病机制：磷酸化异常与多种疾病相关，如癌症、神经退行性疾病和糖尿病。
* 药物开发：磷酸化蛋白是重要的药物靶点，研究其调控机制有助于开发新药。

如何做好磷酸化蛋白WB检测？
为了提升Western Blot检测磷酸化蛋白的成功率，我们建议从以下几方面着手优化：

1、通过有效的样本制备提高目的蛋白丰度
制备优质的蛋白质样品是WB 实验的起点，特别是针对低丰度蛋白如磷酸化蛋白、膜蛋白、核蛋白等，建议根据蛋白定位，使用特定的蛋白提取方法对目的蛋白进行富集。选择错误的裂解液会造成样品中无目的蛋白的情况，例如目的蛋白为核蛋白时请勿使用NP-40这类温和的裂解液。

2、有效分离蛋白样品，提高蛋白转印到膜上的效率
为了避免蛋白电泳过程中被降解，选择合适的胶和电泳缓冲液非常重要。中性pH加上温和的样本制备方案，可以让蛋白样品始终处于温和的非酸性条件下，从而保留了完整性并最大程度地减少了蛋白修饰，所以更适用于低丰度蛋白的分离。

经电泳分离的蛋白需要转印到膜材质表面，以便后续抗体能与目的蛋白结合、检测。转印膜要求柔韧易裁剪，耐化学试剂处理，当然最重要的是蛋白载量高，以尽可能提高低丰度蛋白的检测成功率。相对于NC膜，PVDF膜性能优越，是公认的WB专用膜。膜上没有蛋白样品的区域，须用合适的试剂进行封闭，以减少抗体结合到膜上形成高背景。

3、选择优质抗体
抗体优选是低丰度WB检测的关键一环，好的抗体具有高亲和性、高特异性等特点。需注意抗体浓度高并不代表结果好，合理的一抗、二抗以及样品浓度才能保证良好的ECL显色。此外，有些情况下可以选择多克隆抗体，能识别多个表位、提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。

4、选择高灵敏度ECL发光液
做WB实验时，ECL发光液对于实验的成功非常重要，用高灵敏度ECL发光液不仅可曝光得到漂亮的目的条带，还可以节约时间，以及节约昂贵的抗体成本。

5、选择高灵敏度、宽定量范围成像系统
低丰度蛋白检测，需要宽定量范围的成像方式，这样才能获取更好的数据，更有利于下一步半定量分析。

ChemiScope S7 一体式超高灵敏化学发光成像仪是一款高性能、智能化的化学发光成像仪，采用光子无损式成像技术将样品直接与感光芯片接触，无需镜头，极大程度减少光信号损失，提供无与伦比的高灵敏度和低噪声、宽动态范围图像，让您可以同时捕获强、弱蛋白信号，所有目标条带都清晰可见，且背景干净。

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