同位素标记技术揭示衣康酸在肺泡巨噬细胞中的促炎作用
2025-10-31 来源:本站 点击次数:228
衣康酸——巨噬细胞产生的代谢物，传统观点认为其有抗炎作用。近期 Cell Metabolism 研究发现，衣康酸在肺泡巨噬细胞中会促进炎症反应，稳定同位素标记技术在该机制发现中起了关键作用......
Section.01
衣康酸: “人设崩塌”？
衣康酸 (Itaconate) 是巨噬细胞在免疫激活时通过免疫应答基因 1 (IRG1) 途径合成的重要代谢产物。科学界普遍认为衣康酸具有显著的抗炎作用，能够抑制炎症，减少炎症因子如 IL-6、IL-12 的生成。
然而，Shan 等研究团队最新发表在 Cell Metabolism 上的突破性研究得出了一个相反的结论：在组织驻留的肺泡巨噬细胞 (AMs) 中，衣康酸反而表现出促炎作用，显著增强了 NLRP3 炎症小体的活化，促进 IL-1β 等促炎细胞因子的释放。小鼠体内实验显示，衣康酸的处理会加重 LPS 诱导的急性肺损伤，提示在特定微环境下，衣康酸可能“火上浇油”!
图 1. 研究示意图[1]。
这颠覆了我们对它一贯的“抗炎印象”，研究人员是如何发现这一重要实验现象的呢？本期我们就一起分析下~
Section.02
衣康酸促炎: 文献研究思路
Shan 等研究团队采用代谢流分析技术 (Metabolic flux analysis，MFA)，通过使用全 13C 标记的谷氨酰胺 (Glutamine-13C5) 示踪实验，结合气相色谱-质谱 (GC-MS) 和液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 连用技术，精确追踪了衣康酸在肺泡巨噬细胞 (AMs) 中代谢网络的调控机制，明确解释了衣康酸是如何在 AMs 中促进炎症的过程，具体的实验的过程为：
一、细胞模型构建
- 肺泡巨噬细胞 (AMs) 分离：从小鼠肺组织中分离 AMs，纯度高于 95%。
- 骨髓来源巨噬细胞 (BMDMs) 培养：通过体外培养骨髓细胞获取。
二、同位素标记实验
标记策略：使用 glutamine-13C5 进行代谢标记实验；在无血清 DMEM 培养基中添加 2mM glutamine-13C5 替换普通谷氨酰胺。
标记时间：细胞在 37℃、5% CO2 条件下孵育 4 h。
实验分组：对照组：仅用 LPS (100 ng/Ml) 刺激 4 h;衣康酸处理组：衣康酸 (7.5 mM) 预处理 3 h，再 LPS 刺激 4 h；自然丰度对照组：为标记的普通谷氨酰胺培养基，用于本地校正。
图 2. 在用或未用 ITA (7.5 mM) 预处理的巨噬细胞 (AMs) 中，随后用 LPS (500 ng/mL) 刺激 3 小时后，检测到的全 13C 标记琥珀酸 (H)，以及 全 13C 标记琥珀酸与全 13C 标记的富马酸之比。[2]
三、代谢物提取与衍生化
快速淬灭代谢反应：实验结束后，快速用液氮速冻细胞，终止代谢活动。
代谢物提取：使用 80% 甲醇 (-80℃ 预冷) 裂解细胞，离心后收集上清液；采用冻干法浓缩代谢物。
衍生化处理 (GC-MS 分析)：代谢物经 MOX 试剂 (甲氧胺盐酸盐) 和 MSTFA (硅烷化试剂) 衍生，提升 GC-MS 检测灵敏度。
四、质谱分析
GC-MS 检测：检测衣康酸、琥珀酸、富马酸等 TCA 循环中间产物。
LC-MS/MS：MRM，定量 13C 标记代谢物。
五、数据分析
代谢流计算：使用 MetaboAnalyst 5.0 和 SIMCA-P 进行多元统计分析；计算 13C 标记比例，解析代谢通量变化 (如琥珀酸→富马酸)。
关键发现：衣康酸显著抑制琥珀酸脱氢酶 (SDH) ，导致 13C-琥珀酸堆积； AMs 通过增强线粒体复合物 I (ETC-CI) 活性补偿能量缺口，进而激活炎症信号。
Section.03
同位素标记物---科研核心工具
在研究人员探索衣康酸是促进细胞炎症的过程中，稳定同位素标记技术发挥了不可或缺的贡献！
精准解析代谢动态变化
传统代谢组学仅能测定代谢物静态浓度，而 13C 稳定同位素标记技术可动态追踪谷氨酰胺 -13C5 在 TCA 循环中的流向，明确衣康酸抑制 SDH 的关键节点；通过计算 13C 标记代谢物的同位素丰度分布，精确评估代谢通量变化。
区分内源与外源代谢贡献
通过 13C 标记的琥珀酸与未标记物的对比，排除实验干扰，确认衣康酸直接作用于 SDH ；证实衣康酸特异性诱导 AMs 发生代谢重编程，而 BMDMs 未出现相同的代谢表型。
揭示细胞类型特异性调控机制
同位素示踪数据表明，AMs 因肺泡微环境特性 (如低氧、低葡萄糖) 主要依赖氧化磷酸化供能，而 BMDMs 以糖酵解为主；衣康酸通过抑制 SDH 导致 AMs 中琥珀酸累积，进而通过以下机制触发促炎效应：琥珀酸介导的线粒体 ROS 生成增加、激活 HIF-1α 信号通路及促进 NLRP3 炎症小体组装与活化。这些发现建立了代谢物动态变化与炎症反应调控的直接分子关联。
技术灵敏度高
GC-MS 与 LC-MS/MS 的结合使用，全面覆盖 TCA 循环中关键中间体及其代谢物，检测灵敏度高范围宽。
关于 MCE
Section.04
小结
作者采用稳定同位素标记技术，明确解释了衣康酸并非“万能抗炎分子”，其在肺泡巨噬细胞中的促炎作用警示临床开发需谨慎；通过同位素标记技术对传统认知发起了挑战，对靶向治疗打开了一个全新思路，如通过抑制 ETC-CI 或 SDH 活性可能成为缓解肺损伤的一个治疗靶点。未来，随着质谱技术和同位素示踪方法的不断进步，同位素标记技术将会能够更深入、更精细地解析一些细胞和组织层面的代谢网络，从而为理解疾病的本质、发现新的治疗靶点提供更坚实的基础。
Section.01
衣康酸: “人设崩塌”？
衣康酸 (Itaconate) 是巨噬细胞在免疫激活时通过免疫应答基因 1 (IRG1) 途径合成的重要代谢产物。科学界普遍认为衣康酸具有显著的抗炎作用，能够抑制炎症，减少炎症因子如 IL-6、IL-12 的生成。
然而，Shan 等研究团队最新发表在 Cell Metabolism 上的突破性研究得出了一个相反的结论：在组织驻留的肺泡巨噬细胞 (AMs) 中，衣康酸反而表现出促炎作用，显著增强了 NLRP3 炎症小体的活化，促进 IL-1β 等促炎细胞因子的释放。小鼠体内实验显示，衣康酸的处理会加重 LPS 诱导的急性肺损伤，提示在特定微环境下，衣康酸可能“火上浇油”!
图 1. 研究示意图[1]。这颠覆了我们对它一贯的“抗炎印象”，研究人员是如何发现这一重要实验现象的呢？本期我们就一起分析下~
Section.02
衣康酸促炎: 文献研究思路
Shan 等研究团队采用代谢流分析技术 (Metabolic flux analysis，MFA)，通过使用全 13C 标记的谷氨酰胺 (Glutamine-13C5) 示踪实验，结合气相色谱-质谱 (GC-MS) 和液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 连用技术，精确追踪了衣康酸在肺泡巨噬细胞 (AMs) 中代谢网络的调控机制，明确解释了衣康酸是如何在 AMs 中促进炎症的过程，具体的实验的过程为：
一、细胞模型构建
- 肺泡巨噬细胞 (AMs) 分离：从小鼠肺组织中分离 AMs，纯度高于 95%。
- 骨髓来源巨噬细胞 (BMDMs) 培养：通过体外培养骨髓细胞获取。
二、同位素标记实验
标记策略：使用 glutamine-13C5 进行代谢标记实验；在无血清 DMEM 培养基中添加 2mM glutamine-13C5 替换普通谷氨酰胺。
标记时间：细胞在 37℃、5% CO2 条件下孵育 4 h。
实验分组：对照组：仅用 LPS (100 ng/Ml) 刺激 4 h;衣康酸处理组：衣康酸 (7.5 mM) 预处理 3 h，再 LPS 刺激 4 h；自然丰度对照组：为标记的普通谷氨酰胺培养基，用于本地校正。
图 2. 在用或未用 ITA (7.5 mM) 预处理的巨噬细胞 (AMs) 中，随后用 LPS (500 ng/mL) 刺激 3 小时后，检测到的全 13C 标记琥珀酸 (H)，以及 全 13C 标记琥珀酸与全 13C 标记的富马酸之比。[2]三、代谢物提取与衍生化
快速淬灭代谢反应：实验结束后，快速用液氮速冻细胞，终止代谢活动。
代谢物提取：使用 80% 甲醇 (-80℃ 预冷) 裂解细胞，离心后收集上清液；采用冻干法浓缩代谢物。
衍生化处理 (GC-MS 分析)：代谢物经 MOX 试剂 (甲氧胺盐酸盐) 和 MSTFA (硅烷化试剂) 衍生，提升 GC-MS 检测灵敏度。
四、质谱分析
GC-MS 检测：检测衣康酸、琥珀酸、富马酸等 TCA 循环中间产物。
LC-MS/MS：MRM，定量 13C 标记代谢物。
五、数据分析
代谢流计算：使用 MetaboAnalyst 5.0 和 SIMCA-P 进行多元统计分析；计算 13C 标记比例，解析代谢通量变化 (如琥珀酸→富马酸)。
关键发现：衣康酸显著抑制琥珀酸脱氢酶 (SDH) ，导致 13C-琥珀酸堆积； AMs 通过增强线粒体复合物 I (ETC-CI) 活性补偿能量缺口，进而激活炎症信号。
Section.03
同位素标记物---科研核心工具
在研究人员探索衣康酸是促进细胞炎症的过程中，稳定同位素标记技术发挥了不可或缺的贡献！
精准解析代谢动态变化
传统代谢组学仅能测定代谢物静态浓度，而 13C 稳定同位素标记技术可动态追踪谷氨酰胺 -13C5 在 TCA 循环中的流向，明确衣康酸抑制 SDH 的关键节点；通过计算 13C 标记代谢物的同位素丰度分布，精确评估代谢通量变化。
区分内源与外源代谢贡献
通过 13C 标记的琥珀酸与未标记物的对比，排除实验干扰，确认衣康酸直接作用于 SDH ；证实衣康酸特异性诱导 AMs 发生代谢重编程，而 BMDMs 未出现相同的代谢表型。
揭示细胞类型特异性调控机制
同位素示踪数据表明，AMs 因肺泡微环境特性 (如低氧、低葡萄糖) 主要依赖氧化磷酸化供能，而 BMDMs 以糖酵解为主；衣康酸通过抑制 SDH 导致 AMs 中琥珀酸累积，进而通过以下机制触发促炎效应：琥珀酸介导的线粒体 ROS 生成增加、激活 HIF-1α 信号通路及促进 NLRP3 炎症小体组装与活化。这些发现建立了代谢物动态变化与炎症反应调控的直接分子关联。
技术灵敏度高
GC-MS 与 LC-MS/MS 的结合使用，全面覆盖 TCA 循环中关键中间体及其代谢物，检测灵敏度高范围宽。
关于 MCE
Section.04
小结
作者采用稳定同位素标记技术，明确解释了衣康酸并非“万能抗炎分子”，其在肺泡巨噬细胞中的促炎作用警示临床开发需谨慎；通过同位素标记技术对传统认知发起了挑战，对靶向治疗打开了一个全新思路，如通过抑制 ETC-CI 或 SDH 活性可能成为缓解肺损伤的一个治疗靶点。未来，随着质谱技术和同位素示踪方法的不断进步，同位素标记技术将会能够更深入、更精细地解析一些细胞和组织层面的代谢网络，从而为理解疾病的本质、发现新的治疗靶点提供更坚实的基础。
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参考文献
[1] Shan M, et al., Itaconate promotes inflammatory responses in tissue-resident alveolar macrophages and exacerbates acute lung injury. Cell Metab. 2025 Jun 14:S1550-4131(25) 00268-2.
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