研究背景与目的

缺血性心脏病是全球范围内致死率最高的心血管疾病，心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是心肌血供恢复后继发的二次损伤，也是冠脉介入、溶栓治疗中难以规避的临床难题。MIRI病理机制复杂，钙超载是其核心始动环节，可进一步诱发氧化应激、炎症激活、心肌细胞凋亡，最终造成心肌坏死、心功能下降与恶性心律失常。CaMKIIδ作为钙信号下游关键分子，在MIRI介导的电生理紊乱、心肌炎症反应中起到枢纽调控作用，是心血管保护研究的重要靶点。

茯苓杏仁甘草汤（FXGD）源自《金匮要略》胸痹篇，为治疗胸痹短气的经典方剂，组方简单，具备潜在心肌保护价值。但该方剂针对MIRI的心肌保护效应、抗心律失常作用及分子机制尚不明确。

基于此，河北中医药大学李春花教授团队联合河南省医学科学院电生理研究所郝国梁教授开展相关研究，旨在系统评价FXGD对MIRI的保护效果，并依托电Mapping、光Mapping等心脏电生理成像技术，从心肌电活动、钙瞬变动力学层面揭示其作用机制，阐明FXGD是否通过调控钙信号及CaMKIIδ相关通路发挥心肌保护作用，为该经典方剂用于缺血性心脏病防治提供实验依据。

实验方法

（一）FXGD样品制备与成分定性定量分析

根据《金匮要略》记载方药剂量进行现代折算，制备FXGD冻干粉。利用超高分辨液相色谱质谱联用技术（UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap HRMS）对冻干粉与含药血清成分进行鉴定，确定入血原型成分。并使用UHPLC技术，依据2025版《中国药典》确定质控成分，对多批次的冻干粉进行质量控制。

（二）大鼠在体MIRI动物模型构建

建立大鼠冠脉结扎缺血再灌注模型，设置假手术组、模型组、FXGD低高剂量组和阳性对照组，术前连续两周灌胃给药，终点采集心肌与血液样本用于后续检测。

（三）H9c2心肌细胞缺氧复氧（H/R）体外模型

构建H9c2细胞H/R损伤模型，设置分组并引入CaMKII抑制剂KN93，开展细胞水平机制验证。

（四）离体心脏电Mapping、光Mapping及膜片钳检测实验

Mapping成像技术可在二维空间同步可视化记录心肌动作电位、钙瞬变信号，直观呈现心肌电传导、钙动力学的时空变化，是评估心律失常易感风险的前沿技术。

1. 电Mapping（电标测）：

采用MappingLab 128通道阵列电极，将电极阵列贴附于大鼠离体左心室表面，采集心肌局部电位信号。采用50 Hz高频电刺激诱发室速（VT）、室颤（VF），记录各组心脏恶性心律失常诱发率、传导速度（CV）、动作电位离散度（DIS）等参数，量化心肌电传导异质性，评估折返性心律失常发生基础。

2. 光Mapping（光标测）：

采用MappingLab双相机同步光学成像系统，RH237荧光染料标记心肌动作电位，Rhod-2AM钙离子探针标记胞内钙瞬变，实现动作电位与钙瞬变的同步采集。获取动作电位时程（APD）、钙瞬变幅度、钙瞬变恢复动力学等指标，直观观察钙超载、钙信号紊乱，解析钙信号异常诱发恶性心律失常的底层机制。

3. 全细胞膜片钳实验：

采用全细胞膜片钳记录心肌细胞L型钙电流（I_Ca-L），记录I-V曲线，测定FXGD对I_Ca-L的抑制效果并计算IC₅₀，在单细胞层面验证FXGD对钙内流的直接调控作用。

（五）分子生物学检测

采用TTC、HE、TUNEL、Masson、WGA染色及生化试剂盒、Western blot，检测心肌梗死面积、组织形态、凋亡、氧化应激及通路蛋白表达。

实验结果

（一）化学成分鉴定与制备工艺质量控制

经UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap HRMS分析，共鉴定出FXGD入血原型成分19个，明确入血活性物质基础。UHPLC定量结果显示多批次样品特征标志物含量稳定，批间RSD较小，样品制备重复性良好，满足后续药理实验要求。【图1】

图1. 茯苓杏仁甘草汤（FXGD）化学成分定性与定量分析结果

（二）FXGD改善MIRI大鼠心功能，缩小心肌梗死面积

TTC染色结果显示：与假手术（SHAM）组相比，MIRI模型组心肌梗死面积显著增大（P<0.01）；FXGD低、高剂量组和地尔硫卓阳性对照组均可显著缩小心肌梗死面积（P<0.05 或 P<0.01），证实FXGD可减轻MIRI诱导的心肌坏死损伤。

血清心肌损伤标志物检测显示：MIRI模型组cTnT、cTnI、CK-MB、LDH水平较SHAM组显著升高（P<0.01）；FXGD与地尔硫卓干预可显著下调上述指标（P<0.05 或 P<0.01），提示FXGD能够减少心肌细胞破损，降低损伤标志物释放。

多重组织染色结果表明：MIRI模型组H&E染色见心肌纤维紊乱断裂、炎性细胞浸润；Masson染色提示胶原沉积增加、早期纤维化；WGA 染色显示心肌细胞横截面积增大，存在细胞水肿与代偿肥大。FXGD和地尔硫卓可明显改善上述病理改变，减轻心肌纤维化，修复心肌微观结构损伤。【图2】

图2. FXGD缩小心肌梗死面积、降低心肌损伤标志物并改善心肌病理形态

超声心动图显示：MIRI组左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）显著降低，左室舒张末期容积（LVEDV）与收缩末期容积（LVESV）显著增加；FXGD及地尔硫卓显著逆转上述异常，改善左室收缩与舒张功能。心电图结果显示，FXGD及地尔硫卓显著缩短MIRI延长的QT间期与QRS时程，改善缺血心肌的电传导时间与同步性【图3】。

图3. FXGD减轻心肌氧化应激并抑制心肌细胞凋亡

（三）FXGD改善心脏电学与钙调控、降低心律失常易感性

Langendorff离体心脏电Mapping结果显示，MIRI组左室传导速度(LV-CV)显著下降、左室传导离散度(LV-DIS)显著增加(P<0.01)；在50 Hz高频刺激下，MIRI组室速/室颤(VT/VF)诱发率高达93.3%。FXGD及地尔硫卓显著提高LV-CV、降低LV-DIS，并将VT/VF诱发率降至30.0%，显示明确的抗心律失常作用【图4】。

图4. FXGD抑制心肌炎症反应及CaMKIIδ/NF-κB/NLRP3信号通路激活

光学标测同步记录显示，MIRI组90%复极动作电位时程(APD90)及其四分位距(APD90-IQR)、动作电位上升时间显著延长，动作电位传导速度显著降低；钙瞬变90%衰减时程(CTD90)及其四分位距(CTD90-IQR)、达峰时间(Ton)亦显著延长，钙瞬变传导速度显著下降。FXGD及地尔硫卓同步逆转上述动作电位与钙瞬变异常，降低电生理异质性，稳定心肌兴奋-收缩耦联(ECC)【图5】。

图5. 电Mapping记录FXGD对离体心脏心肌电传导特性的影响

全细胞膜片钳记录L型钙电流（I_Ca-L）：硝苯地平（NIF，1μM）验证记录体系可靠。FXGD呈浓度依赖性抑制I_Ca-L，IC₅₀=0.026±0.004 mg/mL。稳态激活、失活曲线及I-V曲线表明，FXGD仅降低钙电流密度，不改变通道电压门控特性与峰值电位。提示FXGD依靠减少功能性钙通道数量抑制钙内流、减轻钙超载，不改变通道动力学【图 6】。

图6. 全细胞膜片钳检测FXGD对心肌L型钙电流（I_Ca-L）的抑制作用

（四）FXGD减轻心肌氧化应激并抑制心肌细胞凋亡

DHE荧光染色显示MIRI组心肌ROS、MDA水平显著升高（P<0.01），SOD、GSH-Px抗氧化酶活性明显下降；FXGD与地尔硫卓可逆转上述氧化应激指标，降低ROS与MDA，恢复抗氧化酶活性。TUNEL染色证实MIRI组心肌凋亡细胞比例显著增多（P<0.01），FXGD可明显减少凋亡阳性细胞；WB结果表明MIRI组抗凋亡蛋白Bcl-2下调、促凋亡蛋白Bax上调，FXGD上调Bcl-2并抑制Bax表达，减轻氧化应激介导的心肌细胞凋亡【图7】。

图7. FXGD减轻MIRI大鼠心肌组织的氧化应激与细胞凋亡水平

（五）FXGD抑制心肌炎症反应

血清ELISA结果显示，MIRI组促炎因子白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-18及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平较SHAM 组显著升高（P<0.01）；FXGD及地尔硫卓显著降低上述炎症因子。心肌组织RT-qPCR结果与血清一致，MIRI组相应炎症转录本显著上调，两种治疗均显著抑制其表达【图 8】。

图8. FXGD抑制MIRI大鼠心肌组织炎症反应并调控CaMKIIδ/NF-κB/NLRP3通路

（六）FXGD减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤

CCK-8实验证实，FXGD冻干粉在3~100 μg/mL范围内对正常H9c2细胞无明显毒性，选定10、30 μg/mL作为低、高剂量。H/R损伤后细胞活力显著下降，上清CK-MB、LDH、cTnI、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等损伤及炎症因子明显升高；同时细胞内ROS、MDA上升，SOD、GSH-Px活性与线粒体膜电位MMP下降。FXGD预处理可逆转上述变化，提升细胞活力、降低损伤与炎症因子水平，减轻氧化应激，保护线粒体功能，维持能量代谢稳态【图9】。

图9. FXGD减轻H/R诱导的H9c2细胞损伤

（七）KN93验证FXGD保护依赖CaMKIIδ抑制

机制验证实验中，H/R组细胞活力显著降低､ROS与凋亡率显著升高(P<0.01)，CaMKIIδ抑制剂KN93与FXGD均显著逆转上述损伤。炎症因子蛋白检测显示H/R组IL-1β､IL-6､IL-18､ α表达上调，FXGD与KN93均显著下调。通路蛋白检测显示H/R组p-CaMKIIδ､p-p65､NLRP3､ Caspase-1表达显著升高，FXGD与KN93均显著降低｡且FXGD与KN93联用未进一步增强效应，提示FXGD通过下调p-CaMKIIδ表达抑制CaMKIIδ/NF-κB/NLRP3通路，从而发挥抗氧化､抗炎与抗凋亡作用。

图10. FXGD通过抑制CaMKIIδ/NF-κB/NLRP3信号通路，减轻缺氧/复氧（H/R）诱导的H9c2细胞损伤，发挥心肌保护作用

（八）FXGD含药血清再现心脏保护作用

血清药理学实验选定5%、10%FXGD含药血清（FXGD-CS）作为低、高剂量，该浓度对正常H9c2细胞无明显影响。在H/R损伤H9c2 细胞模型中，FXGD-CS可提升细胞活力、减少CK-MB与cTnI释放，降低细胞凋亡率、胞内ROS水平，下调炎症因子mRNA，并抑制 CaMKIIδ/NF-κB/NLRP3通路蛋白活化。加入CaMKII抑制剂KN93 后，FXGD-CS的保护效应消失，进一步证实FXGD依靠下调p-CaMKIIδ发挥通路抑制与心肌保护作用。

图11. FXGD-CS通过抑制CaMKIIδ/NF-κB/NLRP3信号通路，减轻缺氧/复氧（H/R）诱导的H9c2细胞损伤，发挥心肌保护作用

结论

本研究证实，茯苓杏仁甘草汤（FXGD）可显著改善MIRI大鼠心功能，缩小心肌梗死面积，减轻心肌氧化应激、细胞凋亡与炎症损伤。机制层面，FXGD能够直接抑制心肌 L型钙电流，缓解心肌钙超载；同时通过抑制CaMKIIδ/NF-κB/NLRP3信号通路活化，阻断炎症级联反应。H9c2细胞缺氧/复氧模型与含药血清实验进一步验证，FXGD可减轻H/R诱导的心肌细胞损伤，且其心肌保护效应依赖于CaMKIIδ通路的抑制。综上，FXGD对心肌缺血再灌注损伤具有明确保护作用，有望成为防治MIRI的潜在药物。