关键词：轴突；冷冻电镜；微管晶格

神经突起内细胞质致密，冷冻电镜对比度不足，难以解析分子结构。本研究提出Ghost Neuron制备技术，以短暂低渗处理结合冷冻前受控机械破裂去除质膜、降低胞质密度并保留神经突形态，以3.59 Å与3.9 Å分辨率解析轴突微管的扩展与紧凑晶格构象，鉴定出cofilin完全装饰的肌动蛋白丝，为关联分子结构与神经元组织建立平台。

该研究由Satish Bodakunta、Julia Marelli、Victor Vasquez-Montes、Simon Glauser、Christian Biertümpfel、Naoko Mizuno完成，题为“Ghost Neuron preparation unlocks high-resolution structural mapping of intracellular architecture in axons”，2026年9月在线发表于《Nature Communications》。

重要发现

01

方法建立与条件优化

作者以小鼠胚胎第15.5天丘脑外植体为对象，培养于包被的电镜载网上，体外第8天时培养基渗透压约为320 mOsm。比较240、160、80、0 mOsm四档渗透压的作用。荧光显微镜显示，降至160 mOsm时轴突形态在10分钟内保持不变，线粒体运动亦无显著变化；80 mOsm则使轴突膜出现小肿胀、线粒体运动明显下降；0 mOsm在冷冻电镜下导致样品破碎。据此选定160 mOsm为折中条件，该渗透压下神经元可保持形态完整达24小时。完整流程为：低渗孵育约5分钟后，用滤纸印迹实施机械破裂，随即投入液态乙烷快速冷冻实现玻璃化，去除质膜的同时保留细胞骨架架构与神经突轨迹。

Ghost Neuron（幽灵神经元）样品制备示意图

02

光镜验证膜破裂时机

为明确质膜去除时机，作者利用可透过完整细胞膜的荧光标记微管结合化合物Epothilone B检测膜完整性。结果显示，仅低渗处理的神经元无标记，说明低渗孵育本身不破坏质膜；低渗后再行滤纸印迹的样品在160与80 mOsm条件下出现强烈微管标记，表明膜破裂发生于印迹这一机械步骤，与冷冻电镜观察相互印证。研究还借助膜染料MemGlow与线粒体示踪染料MitoTracker开展活细胞成像，为后续结构分析提供光学质量依据。

低渗处理对神经突起整体形态的影响

温和低渗条件可维持线粒体运动能力

冷冻电镜下观察的幽灵神经元

03

肌动蛋白丝与cofilin装饰结构解析

去除质膜后对比度提升，单颗粒分析可直接用于突起内的内源大分子复合物。作者从Ghost Neuron样品中重构出神经元F-肌动蛋白结构，分辨率达3.24 Å。样品中存在被cofilin完全装饰的肌动蛋白丝亚群：总计1528 nm的分析长度中21.7 nm呈连续装饰，研究利用其中的2328个对称粒子重构出5.32 Å分辨率的装饰丝结构。二级结构指认与主链追踪确认结合蛋白为cofilin，与体外cofilin-肌动蛋白复合物结构一致，拟合相关系数达0.97，且装饰使肌动蛋白丝呈扩展构象。与体外cofilin沿肌动蛋白丝间断成簇结合不同，神经元内的肌动蛋白丝呈完全装饰或基本无装饰两种状态，与轴突生长锥等原位冷冻电子断层研究结果一致。

04

轴突微管晶格构象的分子分辨率定位

对轴突微管的单颗粒分析揭示两种晶格构象，分辨率分别达3.59 Å与3.9 Å，均呈经典13原丝结构。分类显示约61%片段呈扩展构象（异二聚体间距83.1 Å）、39%呈紧凑构象（81.2 Å），与体外重构微管的扩展（约83 Å）与紧凑（约81 Å）晶格间距相符。研究共分析172张显微图、7787根微管（累计1296 μm），以82 Å步长切分158108个片段，其中78882个参与构象分类，独立运行间一致性达94.8%–96.6%。通过覆盖两根原丝的聚焦掩膜精细重构，每个粒子报告约一个异二聚体尺度的局部晶格状态，从而在单分子水平观察到扩展与紧凑斑块沿单根微管共存。

借助高倍率拼接成像，作者将高分辨结构回投至神经突轨迹：先以微管相对神经突方向的角度分布（均小于90°，正端向外）验证轴突身份，再定位各段构象，显示扩展晶格片段以镶嵌斑块形式分布于轴突微管杆部。就晶格间距成因，经典观点认为扩展晶格对应GTP样状态、紧凑晶格对应GDP-微管蛋白，但近期发现人诱导多能干细胞来源神经元轴突微管虽结合GDP却呈扩展的GTP样晶格，提示间距并非单纯由核苷酸状态决定；本研究以扩展构象为主的结果与此一致。关于轴突微管稳定性有两种模型：中心微管更稳定而外周更动态，或单根微管内部存在稳定性不同的交替结构域；本研究结果支持后者。作者还评估制备诱导构象改变的可能：轴向重复间距与体外及完整细胞中的标准值吻合，分类高度可重复，且膜破裂发生在冷冻前极短时间内，难以完成核苷酸交换等协调性晶格重塑，所观察的晶格异质性主要反映样品中原已存在的结构状态。

低渗处理结合机械滤纸吸液可造成质膜破裂，实现幽灵神经元样品制备

创新与亮点

本研究突破的核心难题，是神经突起这类细长结构难以高分辨率冷冻成像：其厚度虽在冷冻电镜适用范围之内，但致密胞质与丰富的膜性细胞器严重降低图像对比度，限制对准精度与分辨率。Ghost Neuron技术通过低渗处理与冷冻前受控机械破裂，在保留神经突几何拓扑的前提下去除质膜、降低胞质密度，将分子结构信息精确映射回神经元组织结构；与依赖化学固定和金属镀膜的经典破膜法相比，该流程全程保持冷冻水合状态，与高分辨率冷冻电镜天然兼容。在应用价值上，该平台适用于原代神经组织、诱导多能干细胞来源神经元、基因敲除与疾病模型及表达荧光标记的神经元，可与荧光显微镜关联成像，为神经退行性疾病中细胞骨架异常、轴突转运障碍等机制研究提供分子水平结构证据；其直接解析内源复合物的能力，也为发现神经元内未知复合物开辟途径。

总结与展望

本研究建立的Ghost Neuron制备方法，一次制备同时提供用于拓扑定位的连续细胞骨架支架与适用于高分辨率单颗粒分析的内源复合物池，实现了分子结构与神经元组织背景的关联。未来，结合深度学习辅助的颗粒识别与平均技术，有望提升亚细胞结构鉴定效率；拓展至疾病模型与各类神经细胞类型，可为神经元功能的分子基础研究提供系统性结构视角。同时，如何保留膜相关结构并完整记录细胞内各组分，仍是后续完善方向。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。

Bodakuntla, S., Marelli, J., Vasquez-Montes, V. et al. Ghost Neuron preparation unlocks high-resolution structural mapping of intracellular architecture in axons. Nat Commun (2026).

doi:https://doi.org/10.1038/s41467-026-77741-4