NF-κB（核因子κB）信号通路是细胞内一条至关重要的信号转导通路，参与炎症、免疫、细胞增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程。它就像一位“调控大师”，时刻监控着细胞内外环境的变化，并根据不同的刺激信号，调控基因的表达，决定细胞的命运。

图：NF-κB信号通路展示

From:NF-κB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications.

NF-κB信号通路的组成
NF-κB/Rel蛋白家族：包括p65、p50、p52、RelB和c-Rel五个成员，它们可以形成同源或异源二聚体，发挥转录因子功能。
IκB蛋白家族：包括IκBα、IκBβ、IκBε等，它们与NF-κB二聚体结合，将其滞留在细胞质中，抑制其活性。
IKK复合物：由IKKα、IKKβ和NEMO三个亚基组成，负责磷酸化IκB蛋白，导致其降解并释放出NF-κB二聚体。

NF-κB信号通路的功能
NF-κB信号通路在多种生理过程中发挥重要作用，包括：
免疫反应：调控炎症因子、趋化因子、粘附分子等的表达，参与免疫细胞的活化、增殖和分化。
细胞存活：调控抗凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡，促进细胞存活。
细胞增殖：调控细胞周期相关蛋白的表达，促进细胞增殖。
肿瘤发生发展：参与肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭、转移、血管生成等过程。

NF-κB信号通路的调节机制
NF-κB信号通路的激活过程涉及多个步骤，其中磷酸化修饰是关键环节。在静息状态下，NF-κB二聚体与抑制蛋白IκB结合，被滞留在细胞质中。当细胞受到外界刺激时，IκB激酶（IKK）复合物被激活，进而磷酸化IκB蛋白，导致其降解并释放出NF-κB二聚体。随后，NF-κB二聚体发生磷酸化修饰，并转运入核，与靶基因启动子区域结合，调控基因转录。

靶向NF-κB信号通路：磷酸化蛋白成药
由于NF-κB信号通路在癌症中发挥重要作用，靶向该通路的药物研发成为热点。其中，针对NF-κB信号通路中关键磷酸化蛋白的药物开发更是备受关注。例如：
IKK抑制剂：抑制IKK活性，阻止IκB磷酸化和降解，从而抑制NF-κB信号通路的激活。
IκB降解抑制剂：阻止IκB降解，维持NF-κB二聚体与IκB的结合，抑制NF-κB信号通路的激活。
NF-κB二聚体抑制剂：直接抑制NF-κB二聚体的磷酸化、核转运或DNA结合活性，阻断NF-κB信号通路的传导。

图：NF-κB相关疾病

TR-FRET技术：NF-κB信号通路磷酸化检测的“利器”
为了深入研究NF-κB信号通路的调控机制，并开发出更有效的靶向药物，准确检测NF-κB信号通路中关键蛋白的磷酸化水平至关重要。TR-FRET（时间分辨荧光能量共振转移）技术作为一种高灵敏度、高特异性的检测方法，在NF-κB信号通路磷酸化检测中展现出独特优势：

TR-FRET 均相采用的双抗夹心检测模型，特异性识别磷酸化位点来检测蛋白磷酸化水平，轻松实现2小时检测磷酸化蛋白和总蛋白，检测技术特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简单。

图：TR-FRET 磷酸化/总蛋白检测原理及流程示意图

图：Phospho-NF-kB 和Total NF-kB相关数据

诺华ISAC研究中，一篇名为Preclinical Characterization and Phase I Study of an Anti–HER2-TLR7 Immune-Stimulator Antibody Conjugate in Patients with HER2+ Malignancies文章中提及的NF-kB的磷酸化检测方法：使用TR-FRET技术进行检测。用MIM697处理1h，检测THP-1细胞内的磷酸化NF-kB。使用TC处理的96孔板培养THP-1细胞，200ml培养基中加入125ng/mL PMA，37℃，5%二氧化碳孵育48h，生成贴壁细胞。去除培养基，用200 mL不含PMA的培养基替换，37℃，5%二氧化碳下静置24小时。去除培养基，在细胞中加入50 mL的培养基。MIM697用培养基连续稀释，在试验孔中加入50 mL。在37℃，5%二氧化碳下孵育1h。按照贴壁细胞二板检测方案进行检测。裂解液转移到384孔板，与检测抗体在4℃下孵育过夜后进行检测。

TNFSF与TNFRSF结合相关检测
1、TNFSF与TNFRSF蛋白
TNF-α Protein, Human和TNFR-1/CD120a Protein, Human结合验证数据：

图：TNF-α Protein, Human和TNFR-1/CD120a Protein, Human。EC50：0.167μg/ml.

图：Anti-His antibody Immobilized on CM5 Chip captured TNFR-1/CD120a His Tag, Human (Cat. No. UA040028), can bind TNF-α, Human (Cat. No. UA040005) with an affinity constant of 0.106nM as determined in SPR assay.

2、TNFSF与TNFRSF TR-FRET结合检测体系
1) TNFa & TNFR1 结合检测

2) TNFa & TNFR2 结合

备注：TR-FRET 磷酸化/总蛋白检测体系，包含100、500、2500、5000、10000 points规格，更多规格咨询