磁珠分选是免疫细胞分离纯化的核心技术之一，在肿瘤免疫研究中应用广泛。但不同于外周血、脾脏等成分相对单一的样本，实体肿瘤组织成分复杂，包含大量肿瘤细胞、基质细胞、细胞碎片与死细胞，淋巴细胞占比低，常出现分选纯度差、非特异染色高、分选柱堵塞、细胞活率低等问题。

本文以 Balb/C 小鼠 EMT-6 乳腺癌皮下瘤模型的 CD8⁺ T 细胞阳性分选为例，通过四组对照实验，系统验证样本前处理（Percoll 密度梯度富集）与分选柱型号对分选结果的影响，复盘实体瘤磁珠分选不达标的核心原因。

肿瘤组织消化处理

图1：肿瘤组织消化与单细胞悬液制备流程

肿瘤组织单细胞悬液制备流程

实体瘤样本需先通过机械剪切 + 酶消化制备单细胞悬液，核心操作步骤如下：

• 取手术剥离的肿瘤组织，置于预温的 PBS 或培养基中，转移至培养皿内用手术刀充分剪碎

• 加入肿瘤组织解离试剂，置于 37℃、5% CO₂ 环境的摇床中，持续孵育 1 小时

• 依次通过 70 μm、40 μm 细胞筛过滤，去除未消化完全的组织团块

• 若样本红细胞较多，加入 ACK 裂解液处理，随后用培养基洗涤、离心

• 分组处理：一半样本进行 Percoll 密度梯度离心，富集淋巴细胞层；另一半直接重悬计数，用于后续分选

流式结果

1、S 柱分选：纯度看似达标，杂质差异显著

图2：Percoll 富集 + S 柱分选——CD8 阳性细胞纯度 75.9%

图3：Percoll 富集 + S 柱分选——阴性杂质占比 4.4%

Percoll 富集组：CD8 阳性细胞纯度 75.9%，阴性杂质占比仅 4.4%，分群清晰，淋巴细胞群体明确可辨。

图4：无 Percoll 富集 + S 柱分选——表面阳性比例 81.5%

图5：无 Percoll 富集 + S 柱分选——阴性杂质占比高达 45.8%

无 Percoll 富集组：表面看阳性比例达 81.5%，但阴性杂质占比高达 45.8%，非特异性染色严重，淋巴细胞群边界模糊。

2、L 柱分选：活率与流畅度差异巨大

图6：Percoll 富集 + L 柱分选——CD8 阳性细胞纯度 69.6%

图7：Percoll 富集 + L 柱分选——阴性杂质占比 4.7%

Percoll 富集组：CD8 阳性细胞纯度 69.6%，阴性杂质占比 4.7%，分群清晰，非特异性染色轻微。

图8：无 Percoll 富集 + L 柱分选——阳性比例 71.4%

图9：无 Percoll 富集 + L 柱分选——阴性杂质占比升至 54.3%

无 Percoll 富集组：阳性比例 71.4%，但阴性杂质占比升至 54.3%，淋巴细胞群边界模糊，分型鉴定困难。

实验避坑指南

• 未进行 Percoll 密度梯度富集的肿瘤样本，淋巴细胞群边界模糊、难以有效区分；样本中杂质含量高会加剧非特异性染色，大幅提升细胞分群与鉴定的难度

• 未富集样本使用 L 柱分选时流速显著下降，且流速随润洗次数增加持续变慢，第三次润洗耗时可达十余分钟，存在明显的柱体堵塞风险

• 未富集样本肉眼观察悬液浓度偏高，但实际有效活细胞计数与 Percoll 富集组相近，表观浓度升高主要源于大量非细胞类杂质混杂

• 本实验肿瘤样本消化后总细胞量较大，选择上样通量更高的 L 柱适配性更佳