编者按

VIB单细胞中心实验室的负责人Niels Vandamme博士分享了Flex基因表达分析如何以合理的成本提供操作上的灵活性和可扩展性，实现从脆弱样本中获得高质量数据。此外，他们的“独门秘籍”可进一步降低实验成本。

——根特大学VIB单细胞中心实验室负责人Niels Vandamme博士

为科学家扫清研究障碍，充分利用其样本和预算，是VIB单细胞中心实验室的成员们感到兴奋和获得成就感的源泉。强大的单细胞技术（包括Flex基因表达分析）及多年的实践经验是这项能力的核心。

近期我们采访了VIB单细胞中心实验室的负责人Niels Vandamme博士，请他谈谈中心实验室如何支持研究人员，以及他们使用Flex分析时体验到的一些优势。继续阅读本文，了解Flex带来的灵活性，以及Flex如何凭借稳健的数据质量赢得了他们的持续青睐。同时，您还将看到他们如何通过灵活搭配试剂盒这一独特方式，为客户有效降低成本。

作为VIB单细胞核心实验室的负责人，您在引进新技术时会考虑哪些因素？

作为一个团队，我们始终响应用户需求，同时也会预判用户的需求。因此，我认为制定一份完整的未来路线图至关重要，可确定哪些需求将得到充分满足。我们试图确定哪些有望成为长期的技术和技术平台，以解决当前的瓶颈。

在发现具有颠覆性潜力的技术时，我们会迅速行动并尝试整合。一旦开始，我们要验证该技术是否切实可行。

Niels Vandamme博士与VIB单细胞核心实验室的项目经理Ria Roelandt正在使用Hamilton Vantage平台。实验室已在该平台上实现10x Genomics工作流程的全自动化，确保单细胞处理的一致性和可扩展性。
 

Niels Vandamme博士与VIB Spatial Catalyst项目的科学家Elina Kuznecova正在使用Visium CytAssist平台，该平台支持空间转录组学项目，这些项目由单细胞核心实验室和Spatial Catalyst团队共同维护和优化。

在采用单细胞测序开展项目时，与您合作的研究人员最常担心或考虑哪些因素？

他们通常担心这套工作流程过于复杂。我们能轻松调整和适应，并打消他们的顾虑，因为单细胞核心实验室作为某种一站式平台，可提供从始至终的服务。我们提供清晰的预算概览，以及全套服务的考虑因素，包括单细胞分选、测序和数据处理等。

在新项目启动时，研究人员会考虑起始量要求和样本完整性。他们往往担心是否能收集足够的细胞，或是否有足够的材料或细胞核用在项目中。

第二个考虑因素通常是预算。是否能在特定的预算范围内完成实验？这涉及到研究目标与实验资金之间的权衡取舍。

近年来我注意到，另一个新兴关注点是备受重视的重复性问题。人们不仅要求实验结果具有生物学意义，还要求多次实验之间具有可重复性。

关于可重复性，用户关心的其他问题包括：避免批次效应，确保实验设计正确，杜绝实验混杂因素。若他们使用新的分析或化学试剂，作为核心实验室，我们有责任确保重大项目全程使用相同的化学试剂。

许多用户低估了数据分析与解读的难度。我们通常将其视为潜在问题：分析的复杂性可能令人望而却步。为此，我们在数据生成前就早早做好准备，向用户解释实际上可回答哪些生物学问题，以及需要哪些实验设计、深度和重复次数来支持这些问题。

为了降低分析门槛，我们提供结构化的质量控制报告和标准化数据包，用户可在我们的在线可视化浏览器中直接查看，这种浏览器与Loupe Browser互为补充。我们还提供Seurat培训课程，帮助用户解读结果并微调分析。同时我们与内部的生物信息学家紧密合作，让研究人员从原始数据顺利过渡到生物学见解，避免因技术复杂性而迷失方向。

您如何帮助研究人员确定单细胞测序项目的合适方案？

我们总是从共同讨论开始，明确他们的生物学问题以及期望的分辨率。他们想研究哪些物种、组织、细胞类型和细胞数量？他们仅仅需要转录本还是需要不同方式（CITE-seq、ATAC、多组学等）？

我们首先要弄清他们的需求，再评估具体的限制因素。例如，细胞数量，特定组织解离的考虑因素，是否涉及到特别难处理的细胞类型？是否有样本固定方案可以推迟多个生物安全级别的考虑因素？最后，讨论往往会停留在我们能为此项目拨出多少预算。

随后我们会匹配最合适的平台：采用液滴技术？还是采用微孔、平板技术？此外，是采用靶向方法还是研究整个转录组？

咨询阶段可能会花些时间。我们试图做好充分准备，因为我们在细胞分选、分离、特定组织消化方面拥有丰富的实践经验，而且在近8年的项目中通过核心实验室和VIB积累了庞大的内部数据库。当用户通过电子邮件咨询特定组织时，我们能准确预判可能出现的情况。在咨询会议前，我们会回顾过往项目，以便充分准备。同时我们也希望用户了解到：我们关注其细胞类型的预期结果，以及可能出现的陷阱和问题。

如果存在重大的限制或顾虑，我们会建议进行试点实验。例如对一或两个样本进行技术试点，以便进行质量控制。

您认为Flex基因表达分析的哪些特点对核心实验室常规开展的项目最有价值？

我认为三大特点最为重要。首先是固定和存储样本的能力，这为时间安排提供了灵活性。对于多中心研究或多地点操作而言，这具有革命性意义，我们核心实验室本身也是多地点运行。这种化学方法耐受冷冻保存。对我们来说，确保样本采集与文库制备的环节顺利脱钩至关重要。此外，Flex还展现出卓越的数据质量。我认为其表现超出人们预期，堪称顶级水准。第三个促使人们选择Flex的优势在于多重分析策略导致成本降低。

我们最先发现的是固定优势，之后逐步意识到它具有极其出色的质量和稳定性。

我们使用Flex分析已有两三年了，但从未遇到过与分析相关的失败案例。数百个项目中仅有两次失败，而且均与样本相关。

您认为将样本采集与文库制备分开能为用户带来哪些好处？Flex分析如何支持这一过程？

Flex不仅仅是一种化学方法，它已成为一种赋能的工作流程，将单细胞分析能力延伸至我们实验室之外。我们宣传Flex不仅能测序样本，更是存储样本的新方式。在我们的研究所和相关生态系统中，这自然改变了生物学家对样本保存的看法以及对未来分析的意愿。想想人们通常是如何保存生物材料的：快速冷冻组织，使用RNAlater（一种储存试剂）或固定样本用于组织学分析。Flex完全融入了这种思维模式，不过是针对单细胞悬液。

在我们周围，许多实验室已常规生成单细胞悬液用于流式细胞术或分选。因此我们不断追问研究人员：为什么不采用这种后续可以随时测序的方式来保存这些悬液？我们向他们分发小规格固定试剂盒和单页操作方案(1)。

这些是自制的试剂盒，让每个样本独立开展反应。我们提供单独的“小盒子”，其中含有10支管。10x Genomics的每种缓冲液均按照单样本用量分装。每支管上均标明操作步骤（如加入xx µl H2O和xx µl 37% PFA等）。我们还为研究人员提供分装好的50%甘油溶液，并附带销售小规格的37% PFA试剂管。实际上，我们为他们提供了所有必需品！对于某些实验室，我们会提供一个大规格的48反应试剂盒，但这种情况很少见。

Vandamme博士慷慨提供了核心实验室的样本固定方案(1)。

核心实验室是否参与了某个令人兴奋的项目或研究成果，其中使用了Flex？

作为核心实验室，我们并非专注于单个项目或某一特性的生物学问题。我们参与了数百个使用Flex的项目，覆盖多种组织、样本类型、细胞类型等。每个项目都对我们具有独特意义。所得数据和生物学解读也不会局限于我们的平台，因此很难轻易断言我们正专注于某一”突破性“成果。

对我们而言，技术突破才是至关重要的——我们优化了工作流程，让分析变得切实可行，从而为客户解锁新的研究可能——这一刻对我们至关重要。一旦瓶颈得以消除，便是我们倍感自豪、也是最具成就感的时刻。

让我们感到兴奋的成果之一是snPATHO-seq(2)方法。我们将FFPE组织作为Flex分析的起始材料，因此我们确实能使用生物存档的材料。这些样本并非为单细胞测序而准备，在采集和固定这些组织时，研究人员并未考虑过开展单细胞测序。这开启了大量此前无法使用的新队列。

以FFPE作为起始材料，我们正推出人类和小鼠样本的大量操作方案。胰腺样本曾让我们大费周折，但如今我们发现胰腺样本在Flex分析中的表现优于逆转录分析或单细胞核。我们还发现富含中性粒细胞和粒细胞等脆弱细胞类型的样本也能很好地保存。因此我们对Flex分析、固定过程以及单细胞封装所用的GEM-X流程充满信心。我们在Flex分析中使用定制探针，如今也使用CRISPR技术。

此时此刻，这些进展令人兴奋，而且技术还在不断发展。这不仅仅是固定样本并开展传统测序。我们还在探索Flex分析是否能完成新任务，而我们总是设法助其成功。

在使用FFPE材料进行Flex分析时，您是否有其他的质量控制建议？您如何确保最高质量的结果？

FFPE材料在Flex分析中效果不错，这出乎我们的意料。首先我们会检查样本年限及原始制备方式。保持固定和包埋程序的一致性往往比任何下游优化都更重要。我们还利用DV200评分来评估RNA质量。

对于一些新收到的样本，我们会同时进行Flex和Visium HD分析的QC检查。如果我方或研究人员存在疑虑，我们会建议先进行小规模试点检测。如果试点结果良好且后续项目扩大规模，我们会登记或抵消试点成本。这是我们维护科学诚信并保护双方声誉的方式，毕竟以高成本处理大批低质量的样本对任何人都无益。

您在核心实验室开展的一些工作进一步降低了Flex的单样本成本，请您给我们介绍一下。

我们将低通量试剂盒与高通量试剂盒混搭。这种混搭策略让条形码可与GEM-X试剂分开管理。因此我们拥有完整的条形码和GEM-X库存。我知道能开展多少个反应以及能分析多少个样本。我们采用统一的线性定价模式，这样用户可选择1、2、3、4、5、6等任意数量的样本。我们不再局限于4或16个。这是一种统一的定价模式，随着样本数量递增而单价递减。

Vandamme博士提供的增量式统一定价模式的示意图（1-16个样本）。总成本随样本数量成比例增加，而单个样本的成本则相应减少。这种连续定价结构取代了固定套餐规格（如1、4或16个样本），采用灵活透明的模式，能够自然适应实验设计的变化。

对研究人员来说，这种全包式定价模式极具吸引力。他们只需要根据实际提供的样本数量付费，在1到16个样本范围内享有可预测的递增成本（包括基础测序费用），而不用受限于1、4或16个样本的固定套餐规格。这种模式为整个工作流程带来了灵活性以及透明的成本预期。

您认为单细胞测序或Flex分析最具潜力的增长点在哪里？是否有您特别期待的新功能？

关于Flex分析，我认为自动化的无人值守样本制备或样本处理工作站或解决方案将助力核心实验室的扩展。目前在固定样本后仍需大量手动操作，因此我们正在积极探索：在进行杂交和混样之前，如何利用各种类型的上游定量方法和质控流程绕过去。

我认为Flex的多重分析功能最终将通过96个条形码或384个条形码的试剂盒实现，从而推动更大规模的分析。

单细胞测序的增长潜力如何？五年前，每个人都在讨论空间和多组学，比如RNA、ATAC、蛋白质和甲基化等。我认为这些方向仍然有效，但增长点不再来源于单一突破，而是通过整合现有的技术实现更深度的分析。

关键在于融合，利用更加整合的多组学分析。目前整合各个生物层面的项目仍极为有限。我认为应当更多地整合多个层面，并在数据分析层面使用AI工具，为现有的图谱或数据注入新内容。

我认为Flex分析将在其中发挥核心作用，让未来的研究实现标准化的样本库存储和固定。我期待看到更多基于固定技术的可靠分析，不仅限于基因表达和蛋白质分析。

通过参考资源的链接继续探索VIB单细胞核心实验室的服务(3)，或了解Flex基因表达分析(4)。10x Genomics最近推出了采用板式混样技术的Flex分析(5)，提供模块化的试剂盒选项，支持灵活的批量处理，并独立销售核心试剂以满足您特定的实验设计，这将让众多研究人员和核心实验室受益。

为了清晰起见，并考虑到篇幅限制，访谈内容有所删减。感谢Vandamme博士对本文的贡献！

参考资源：

1. https://www.single-cell.be/flex
2. https://www.nature.com/articles/s42003-024-07043-2
3. https://singlecellcore.sites.vib.be/en/services
4. https://www.10xgenomics.com/cn/products/flex-gene-expression
5. https://www.10xgenomics.com/cn/products/flex
 

北京怡美通德科技发展有限公司是10x Genomics的官方授权代理商，代理美国10x Genomics公司生产的Chromium单细胞测序建库系列产品、Visium空间转录组系列产品以及Xenium组织空间原位分析系统，提供仪器配套的试剂耗材供货、产品演示实验、产品安装、使用培训以及售前售后技术咨询、生物信息学分析等相关技术服务。