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图9. 类器官构建、培养、传代流程。
a、类器官构建全流程示意图；
b、洗涤后状态对比：无类器官残留(左)、存在BME残留(中)、可见完整类器官(右)；
c、12孔板中BME液滴分布图(比例尺：5 mm)；
d、BME与基质胶培养体系下乳腺类器官形态对比，两者生长状态相似 (比例尺：100 μm)；
e、单细胞传代与5-20个细胞团传代后类器官生长情况 (比例尺：100 μm)；
f、含有细胞碎片的类器官培养图像 (比例尺：100 μm)；
g、不同接种密度下类器官生长状态：密度过低 (左)、过高 (中)、适宜 (右)(比例尺：100 μm)；
h、传代时机判断：类器官呈汇总状 (左) 或类葡萄状 (右) 时可进行传代 (比例尺：100 μm)。

为降低实验过程中粘附损失，所有耗材 (如玻璃培养皿、吸管、Falcon 管、细胞筛) 均需使用 D-BSA (500mL DMEM GlutaMAX 含有 5mL 双抗 (P/S) 5mL10% BSA，BSA 粉末溶于 DPBS) 溶液预润洗。

组织来源乳腺癌类器官构建^[1]

(1) 组织保存与样本留样

新鲜组织样本需置于含100 μg/mL Primocin?的adDMEM/F12⁺⁺⁺ (Advanced DMEM/F12 中添加 5 mL 双抗，5 mL GlutaMAX 和 5 mL HEPES) 培养基中。4℃ 保存不超过 72 h。同时，应进行系统化样本留样，以备后续分析：

• 形态学记录：对组织大小、脂肪含量、血管浸润及坏死区域等进行拍照存档。
• DNA 样本：取 2-4 mm³ 组织片段，经 70% 乙醇清洗后，干冰速冻并于 -20℃ 保存。
• HE 染色样本：将等量组织块固定于 5 mL 4% 福尔马林中。
• 多组学样本：取等量组织块，干冰速冻后转入 -80℃ 保存，用于后续转录组及蛋白组学分析。

 
(2) 组织消化

使用手术刀将组织剪切至约 0.5-1 mm³的碎块，转移至 50 mL Falcon 管中，先后用 D-BSA 溶液清洗两次以去除杂质。弃上清后，加入10 mL Type 1 (配方见表 1)培养基，并补充 500 μL 胶原酶 (1g 溶于 50 mL adDMEM/F12⁺⁺⁺，0.22 μm 滤膜过滤，使用终浓度 1 mg/mL) 及10 μL ROCK 抑制剂 (10 mg 粉末溶于 312 μL DMSO 中，使用终浓度 10 μM)。管口封膜后，置于 37℃ 摇床 (140 rpm) 消化 1-2 h。消化时间需根据组织类型 (正常/肿瘤)、大小及状态灵活调整 (正常组织一般需要 2 h，肿瘤组织一般需要 0.5-2 h)。

(3) 终止消化

消化结束后，加入 1 mL FBS 终止反应，并用 D-BSA 预润洗的吸管轻柔吹打混匀。

(4) 过滤与清洗

使用 100 μm 细胞筛过滤消化产物 (不更换滤筛以减少损失)。滤液经 450 g、8℃ 离心 5 min 后弃上清，剩余约 4 mL 液体转至 15 mL 管，加入 10 mL D-BSA 重悬清洗，再次离心后小心吸弃上清，保留约 1 mL 液体。

(5) 裂红 (可选步骤)

若沉淀呈红色，可加入 1-2 mL 红细胞裂解液，室温孵育 2 min。

注意：溶液中组织样本＜100 μL，使用 1 mL 红细胞裂解液，样本＞100 μL，使用 2 mL 红细胞裂解液。

(6) 细胞悬液制备

向沉淀中加入10 mL D-BSA 清洗离心后，吸弃上清，根据沉淀体积按比例加入基底膜提取物 (basement membrane extract , BME)(通常按 50 μL 沉淀加入 200 μL BME 的比例) 进行重悬。

注意：此步骤需保持低温操作，防止 BME 提前固化；若悬液黏稠，可使用剪去尖端的平口枪头吹打。

(7) 点胶固化

在 12 孔板中分滴滴加细胞 -BME 混合悬液 (每滴<20 μL)，每孔总量 100 μL 。将培养板倒置于 37℃ 培养箱中固化 30 min，以防止细胞沉淀至孔板底部。

注意：当组织生长量受限时可选择不同的培养耗材来提高，具体使用量见表 2。

(8) 培养与维持

固化后，分别加入750 μL Type 1 与 Type 2 扩增培养基 (配方见表 1)。将培养板继续倒置，置于 37℃、5% CO₂ 条件下培养。每 2-4 天更换培养基，并定期在明场显微镜下观察类器官生长状态并拍照记录。若初始组织量有限，可参考表 2 调整培养耗材规格。

表. 不同规格培养皿使用 BME 的体积