蛋白质糖基化修饰在肺癌的发生、发展和转移中扮演着关键角色，然而，糖肽固有的低丰度与高度异质性，使其检测分析面临巨大挑战。

蛋白质糖基化是重要的翻译后修饰，在肺癌中异常糖基化可促进肿瘤转移、免疫逃逸、上皮-间质转化（EMT）等多种恶性进程。然而，糖肽的宏观和微观异质性给LC-MS/MS检测带来了巨大挑战。目前常用的糖肽富集方法各有局限：MAX（混合阴离子交换）：对带负电荷的唾液酸化糖肽亲和力强，但易非特异性保留疏水性肽段；HILIC（亲水相互作用色谱）：特异性偏低，肽段干扰严重，且对O-连接糖肽覆盖率有限；PBA（苯硼.酸）：需在碱性条件下工作，非特异性吸附高，低丰度糖肽易被竞争性排挤。针对上述痛点，研究团队创新性地将开发出了新型DeepGP富集柱，它能够兼具阴、阳离子糖肽富集的优势。研究首先采用四种富集材料（DeepGP、MAX、HILIC、PBA）对HeLa细胞裂解液及肺癌患者血清进行糖肽富集，经LC-MS/MS分析后，利用PEAKS Studio软件的GlycanFinder模块进行数据解析。

图1. 研究流程概览

图1展示了从样本制备到生物标志物发现的全流程。在HeLa细胞实验中，四种方法共定量到4,801个糖肽（4,021个N-糖肽 + 780个O-糖肽）。其中，MAX定量总数最多（4,067个），N-糖肽数量亦居首（3,599个）；DeepGP位列第二（3,922个），但O-糖肽数量高达598个，为四法之最；HILIC排名第三（3,495个），PBA最低（1,217个）（图2A）。三种方法（DeepGP、MAX、HILIC）共享糖肽达3,609个，占总数的75.9%；共享糖蛋白达346个，占81.6%（图2B、2C）。值得注意的是，DeepGP覆盖了MAX鉴定结果的92.4%和HILIC的93.6%，展现出卓越的广谱识别能力。

图2. 四种糖肽富集方法性能比较

四种方法在糖型偏好上差异显著：MAX偏好高甘露糖型（52.28%），而DeepGP和HILIC均偏好复杂型糖链，其中DeepGP对复杂型占比达37.45%，且在富集岩藻糖基化与唾液酸化糖肽方面尤为突出。此外，DeepGP展现出最高的平行相关性（Pearson相关系数>0.87），远超其他三种材料，表明其富集结果具有极/佳的批内一致性和可重复性。综合评估后，DeepGP被选定为后续肺癌血清糖蛋白组学分析的最稳健平台。

利用DeepGP对9例肺癌（LC）和9例健康对照（HC）血清进行分析，共鉴定出：21,592个完整糖肽（10,482个N-糖肽 + 11,110个O-糖肽）；888个糖蛋白；755个糖链（541个N-糖链 + 214个O-糖链）。其中，复杂型糖链占78%，杂合型与高甘露糖型各占11%（图3B）。LC与HC共享7,074个（93.8%）完整N-糖肽、6,030个（91.5%）O-糖肽以及127个（96.2%）糖蛋白（图3C-F）。唾液酸化糖肽数量在LC组（2,098个N + 977个O）明显高于HC组（1,738个N + 922个O）；岩藻糖基化糖肽同样呈现LC组（4,403个N + 3,213个O）高于HC组（3,723个N + 2,848个O）的趋势。PLS-DA分析显示，LC与HC样本显著分离，且LC组样本在空间上更为分散，提示肺癌患者血清糖基化具有更高的异质性（图3J）。
经Bonferroni多重检验校正后，共鉴定出2,069个差异糖肽（1,340个上调，729个下调）。COG功能分类显示，差异分泌性糖蛋白主要富集于转录调控、翻译后修饰、蛋白质周转与分子伴侣功能，以及信号转导机制（图4C）。GO富集分析涉及先天免疫应答、炎症反应和免疫球蛋白受体结合（图S8A）；KEGG通路富集则指向癌症中的蛋白聚糖信号通路，该通路在癌细胞的增殖、黏附、血管生成和转移中发挥关键调控作用（图S8B）。

图3. 肺癌与健康对照血清的N-/O-糖肽分析

图4. 差异糖肽的功能分析 

经严格筛选（FC>2或<0.5，p<0.005），最终确定424个差异糖肽（含229个N-糖肽）。综合AUC值、峰面积和MS²谱图质量，选出四个候选生物标志物。其中，单个标志物AUC均超过0.85，展现出优异的诊断能力；而四者联合的AUC更是达到0.978，显著优于单一标志物（图5C、5D）。以AACT-N106-H7N6S4F1为例，其MS²谱图中m/z 803.29（H1N1S1F1）的诊断性离子，证实了末端唾液酸Lewis结构的存在（图5E）。值得注意的是，AACT N106位点共鉴定出52种不同糖肽，其中H7N6S4F1的AUC（0.89）显著优于该位点其他N-糖链，说明糖链的精细结构本身，而非单纯的糖基化位点，才是决定诊断价值的关键（图5F）。

图5. 四种生物标志物的结构、表达及ROC分析

综合全文数据，DeepGP相较传统方法具备以下突出优势：

1. 同时高效富集N-和O-糖肽：多数方法难以兼顾两类糖肽，而DeepGP在HeLa细胞中鉴定出598个O-糖肽（四法最高），在血清中更鉴定出11,110个O-糖肽。
2. 高重现性：Pearson相关系数>0.87，远优于其他材料，适合大规模临床样本分析。
3. 偏好功能相关糖型：DeepGP偏好复杂型糖链（37.45%），并能富集更多岩藻糖基化与唾液酸化糖肽，这些糖型与肿瘤进展密切相关。
4. 广覆盖且互补性强：DeepGP覆盖MAX鉴定结果的92.4%和HILIC的93.6%，在保证广覆盖的同时，提供了独特的O-糖肽信息，形成有效互补。

本研究首次开发了兼具多重富集特性的DeepGP平台，通过整合亲水相互作用与多价结合机制，克服了单一富集方法的固有缺陷。发现的四个位点特异性糖肽标志物具有极高的诊断准确性（单指标AUC>0.95，联合AUC达0.978），为肺癌的早期筛查、预后评估和治疗监测提供了新型无创工具。

此外，研究系统揭示了肺癌血清中唾液酸化与岩藻糖基化水平的普遍升高，并发现差异蛋白富集于补体/凝血级联、胆固醇代谢及癌症蛋白聚糖信号等关键通路，深化了我们对肺癌糖基化病理机制的认识。

DeepGP作为一种高效、稳健、可规模化的糖肽富集技术，不仅为糖蛋白组学基础研究开辟了新途径，也为肺癌精准诊断和个性化治疗提供了重要的技术支撑。

百蓁生物基于DeepGP平台以及GlycanFinder软件，构建了完整的糖蛋白质组学分析以及糖蛋白质标志物发现的全流程服务体系，期待该策略能够进一步推动相关领域的发展、早日走向临床转化，造福更多患者。