上世纪70年代以来，受传统能源价格、环保及资源有限等因素的影响，世界各国日益重视可再生绿色能源，如太阳能、风能、水能和生物能的开发和利用。如我国最近大部份地区出现的雾霾天气就是由传统能源的过度使用而造成的，如何尽快转变能源供给模式，将蓝天还给人民，就摆在了我国科研工作者面前。其中各种替代方法中，以利用生物基质（植物、微生物等）开发出的各种生物燃料所带来的社会效益和经济效益越来越受到大家广泛的关注。生物燃料泛指由各种植物或微生物资源可转化为固体 、液体或气体形式的一种燃料，具有良好的可贮藏性和易运输性。然而，传统方法是使用各种粮食来生产生物燃料（如乙醇），被称之为第一代生物燃料，但是此方法有其不可避免的缺陷，首先燃料乙醇作为汽油替代品，其水溶性、挥发性、热值低等缺点制约着其大规模使用，其次以粮食作为原料生产燃料乙醇的这种方法也备受争议（图一）。

因此各国科学家都开始研究可替代的先进生物燃料，先进生物燃料(Advanced biofuel)是指以高产非粮作物、农林废弃物、其他可持续性生物质或者藻类为原料，通过化学、物理、生物甚至必要的组合技术，转化获得的具有与化石燃料相当甚至更高能量密度，易于储存和运输的燃料分子。先进生物燃料研究目前有两个方向， 其一是通过改造微生物代谢途径而直接生产可被利用的生物燃料，如美同加州大学洛杉矶分校学者通过合成生物学手段改造大肠杆菌Escherichia coli氨基酸生物合成途径，合成了一系列碳链稍长的醇类化合物，并且大幅度提高了产量，为生物汽油发展提供了新思路；其二是针对传统微生物（如大肠杆菌、酵母菌等）改造，使其能够合成特异性酶类分解纤维素，从而生产生物燃料；如前些年美国麻省理工学院的一个学生研究小组发明了一种用微生物产生的酶类来分解废弃植物纤维产生电能的生物燃料电池，它可专门用来为手机充电。众所周知纤维素是地球上最丰富的可再生自然资源，例如我国每年仅作为秸秆的纤维素产量就达2亿吨以上，那么如果将如此丰富的自然资源转化为生物燃料将是一种不错的选择。

 

我们知道有些纤维素具有很强的抗降解屏障，而传统化学降解的方法需要强酸和高温的一个环境，即污染了环境又增加工业生产成本，而采用纤维素降解酶的方法与化学降解方法相比较具有很多优势，但是目前也存在很多有待解决的问题，如有些纤维素酶由于其热稳定性差、pH耐受范围较窄以及活性低而无法满足不同工业应用需求，需要挖掘具有高活性和稳定性的新纤维素酶，很多能够筛选出的具有高生物活性和高稳定性的纤维素酶的细菌、放线菌或真菌（图二），但在实验室条件下很难进行纯培养。如何有效弥补某些微生物在无法适应实验室环境下进行纯培养呢？

 

 

环境微生物基因组，也称之为宏基因组，通过对其筛选能够有效的帮助我们解决上述问题。宏基因组学诞生于上世纪90年代，是指不经过微生物培养阶段，采用直接提取环境中总DNA的方法（目前主要指环境中细菌和真菌基因组总和），对微生物基因总和进行研究的一门新学科。宏基因组技术的出现，使得人们对占微生物总体99% 以上不可纯培养的微生物的研究成为现实。它的应用主要有两方面：一方面是筛选功能基因, 开发具有所需功能的蛋白，另一方面是通过对宏基因组文库进行分析, 探讨在各种环境下微生物间相互作用和微生物与周围环境间相互影响的规律。在宏基因组技术的应用范围被不断扩展的同时, 围绕着宏基因组文库的构建、筛选、测序和分析等方面的研究已成为宏基因组学发展的主要推动力。文库的构建的方法是在环境样品中提取基因组DNA，根据序列的大小将其克隆到合适的载体（质粒、粘粒或者细菌的人工染色体中），可导入不同的宿主菌体（如大肠杆菌、链霉菌或假单胞菌）中，来筛选出目的转化子。我们知道一个好的基因组文库的大小应足够大，以便包括所有的基因DNA 顺序，目前很多用户采用传统人工转化培养、挑选克隆方式，这种方式有些不可避免的缺陷，首先其增加劳动人员的工作量，其次由于人为原因可能出现误挑、挑选出的克隆来源无法追踪，工作效率低等。往往我们挑选成千上万的单克隆后，仅能获得几个具有活性的克隆。如何提高阳性克隆筛选效率和准确性，使实验人员从简单重复的劳动中解放出来，成为了大家关注的焦点。

 

1991年成立于英国Genetix公司一直致力于高通量全自动微生物克隆筛选系统的研究和开发，并于1993年推出了世界上第一台QPix高通量全自动微生物筛选系统。经过二十年的发展，目前QPix系统在全球有超过600台的装机量，因此它也建立了微生物克隆筛选方面的行业标准，已知世界八大测序中心，其中有七家采用了QPix系统，2011年Genetix公司加入Molecular Devices公司，而后Molecular Devices根据市场的需要，研发并推出了最新Qpix 400系列高通量全自动微生物筛选系统，目前包括QPix460、Qpix450和QPix420高中低三种型号（图三）。

 

图三：QPix460高通量全自动微生物克隆筛选平台 

 

QPix460能够帮助实验人员完成从转化涂板、克隆筛选、文库复制重排等全部工作。QPix400系列产品采用了最新的磁悬浮传动装置，可以有效的提高筛选速度和精确性，QPix400系列高通量全自动筛选系统每天可以挑选30000克隆，而传统人工方式一人一天最多挑选2000个克隆。且QPix高通量微生物筛选系统也采用了特殊金属材质的挑针（图四），优势之一是具有较高的强度和寿命、利于挑针的清洗消毒、又能提高挑选精度和准确性（精度＜10um、准确性＞98%）；优势二既有针对不同微生物类型挑针，如有针对大肠杆菌、酵母菌和噬菌体的挑针，也有针对不实验方法的挑针，如挑选挑针、复制挑针、点膜挑针等。

 

 

QPix400系列产品中加入了条形码读取器和培养基高度自动检测功能（图五），其中条形码读取器可以帮助用户在建库的时方便数据记录和追踪，而高度自动检测功能的原理是利用了超声波探测技术，能准确探测出培养基的高度，可对挑针Z轴的高度进行优化。

 

 

目前大家普遍利用含有刚果红染料的羧甲基纤维素（CMC）琼脂作为培养基，通过宏基因组学筛选方法已经成功的从各种土壤、水牛瘤胃和白蚁后肠中，获得了几株有活性的纤维素酶。然而CMC筛选的方法缺点是不适合高通量筛选、且不能定量及信噪比差等缺点。也报道过其它一些方法，但是多数以琼脂平板作为试验的基质，并不能适合大片段基因组库的高通量筛选。Mewis K等发表在Microbiology and Immunology的一篇文章中提到了利用二硝基酚（DNP）作为纤维素酶底物来显色的方法，他们将文库克隆在pCC1拷贝控制福斯质粒载体上，通过增加拷贝数目来增加检测灵敏度，此方法可一步显色后，利用具有光吸收功能的酶标仪检测其吸光度变化，这种检测方法具有可定量、灵敏度高及全自动化优势。在进行检测以前，首先将构建好的文库（N块384孔板，-80℃取出。放在37℃半小时左右）然后将整板的384孔板进行复制，传统手工方法效率很低，他们利用了Molecular Devices公司的QPix高通量全自动微生物克隆筛选系统所具有的微孔板复制功能，专用的复制挑针，复制挑针模块有两种不同的规格，96根针或384根针，分别对应96孔板或者384孔板，其中96根挑针模块也可以兼容384孔板。如复制10块384板孔（384根针挑头），复制完毕只需要15分钟，大大提高了劳动效率。

 

如筛选出各种酶类都需要进行酶活力评价，传统方式准确率、效率都较低。酶活力评价法就可以利用荧光法作为一种手段，其具有灵敏度高、特异性好等优势，将荧光标记物与目标基因构建于表达载体中转化培养，根据荧光强度高低选择克隆，传统方式需人工在荧光显微镜下进行克隆挑选，工作强度大，QPix400系列高通量全自动微生物克隆筛选系统不但具有亮视场白光成像功能，同时还具有多通道荧光成像功能，这样会大大缩短酶活力评价过程，提高效率(图六)。

 

 

生物燃料作为一种全新能源具有无可比拟的优势，如何加快生物燃料的研发，促进其适应工业化大规模生产，关键是如何在较短时间内快速找到特异性、高产量的微生物，可加速生物燃料发展，高通量筛选仪器作为一种必不可少手段会发挥出越来越大的优势。