研究背景
    乳腺癌是世界范围内女性最常见疾病，目前乳腺癌治疗会结合手术和多种辅助治疗手段。然而在乳腺癌治疗中，化疗药物耐药是治疗一大障碍。因此深度理解药物抵抗、代谢机制实施个性化药物治疗非常重要。吉西他滨(Gemcitabine; 20,20-difluorodeoxycytidine, dFdC)是FDA批准的治疗后复发或转移病人以及蒽环霉素辅佐化疗失败病人的一线药物。90%以上吉西他滨服用都是由胞苷脱氨酶将其转化为2’-deoxy-2’,2’-difluorouridine (dFdU)导致失活。最近研究表明吉他西滨代谢通路中的基因与吉他西滨药物抵抗相关。另外，有研究表明，miRNA在化疗药物抵抗过程中起着关键作用。然而，乳腺癌中吉他西滨药物抵抗潜在的分子机制尚未阐述清楚。该研究中miRNA芯片（Agilent Technology, Austin, TX）以及mRNA芯片（Affymetrix, Santa Clara, CA）服务由上海伯豪生物完成。

研究结果

1. 吉西他滨抗性细胞构建及其性质描述

   为了揭示吉西他滨在乳腺癌中抗药性的分子进化机制，研究者通过将MDA-231细胞系暴露于12个逐渐增加吉西他滨药物浓度产生出了吉西他滨抗药细胞系MDA-231-Germ。MDA-231-Germ 的IC50值比亲代细胞系MDA-231高9倍。用吉西他滨治疗时MDA-231-Germ克隆细胞数目也显著高于MDA-231。为了研究吉西他滨抗性基因，分别对亲代细胞以及耐药性细胞用芯片技术获得mRNA表达谱，并进行GO富集分析发现激活的通路都与药物代谢相关。以上结果说明研究者已经成功建立了吉西他滨抗性细胞系MDA-231-Gem cells。

2. 提高CDA表达能够促进乳腺癌细胞吉西他滨耐药性

    基于以上mRNA表达谱芯片分析发现一些重要的吉西他滨代谢酶主要集中于一个代谢通路中。其中能够通过脱氨基作用失活吉西他滨的CDA在MDA-231-Gem细胞中上调。此外，CDA在MDA-231和MDA-436表达，但是在MCF7, ZR-75-30 ,MDA-468, and Hs-578T细胞系中几乎不表达。而与芯片分析结果一致，CDA在MDA-231-Germ与其他细胞系相比高表达。细胞毒性实验表明，过表达CDA的乳腺癌细胞系具有更高的IC50值。抑制CDA表达能够降低乳腺癌细胞系对吉西他滨的药物抗性。以上结果表明CDA表达与乳腺癌细胞系对于吉西他滨治疗敏感性非常相关。

3. CDA抑制乳腺细胞增殖导致细胞循环重分配

   细胞增殖实验表明CDA表达量高的MDA-231-Gem细胞比其亲代细胞增殖速率慢。CDA过表达能够抑制MDA-231和MCF-7细胞增殖，CDA抑制能够促进MDA-231细胞增殖。因此，可以得出结论CDA能够抑制乳腺细胞增殖。由于CDA在嘧啶转换为尿苷过程其重要调控作用，因此可能会影响核酸池平衡致使复制速率减慢。因此通过检测细胞周期分布发现S期细胞比例在MDA-231-Gem中比亲代细胞明显增加。在MDA-231和MCF-7导入外源性CDA导致S期细胞比例增加。当在MDA-231-Gem导入CDA靶向的shRNA，S期富集现象逆转。以上结果表明CDA在调控细胞周期重分布以及复制过程发挥重要作用。

4. Cyclin E–CDK2复合物及其相关分子参与CDA介导的细胞周期重分布

   Cyclin E–CDK2在控制G1-S细胞周期中起到重要作用，因此本文用Western blot实验分析cyclin E–CDK2 complex，当CDA在MDA-231-Germ中高表达时cyclin E和CDK2下调。而沉默CDA，cyclin E–CDK2复合物表达增加。与cyclin E类似cyclin A表达也与CDA呈相反趋势。cyclin E–CDK2复合物会导致Rb磷酸化不能与转录因子E2F结合使下游基因转录度过G1-S期。磷酸化Rb，Rb表达以及E2F表达与cyclin E–CDK2复合物类似说明CDA水平可能会降低cyclin E–CDK2复合物表达抑制下游通路活性。以上结果说明cyclin E–CDK2复合物以及其相关的分子参与了CDA诱导的细胞周期重分布。

5. miR484作为转录后调控子下调CDA表达

   首先本研究采用多种算法预测CDA的靶基因，得到34个候选miRNA至少被四个算法预测到。34个候选miRNA中有3个在MDA-231-Gem和亲代细胞差异表达。荧光素酶报告试验证实三个miRNA可以和CDA结合。western blot发现miR-484能有效抑制CDA表达。3个miRNA中只有miR-484与CDA表达显著负相关。以上实验说明miR-484可能通过直接靶向CDA 3’-UTR使其表达下调。

6. miR-484/CDA调节乳腺癌细胞吉西他滨抗性、细胞增殖以及细胞周期重分布

   以上结果表明CDA可能是miR-484靶基因，为了进一步验证，过表达miR-484能够引起CDA表达下降，其所表现出的结果和引入shRNA类似。进一步，如果CDA是miR-484靶基因，那么在miR-484表达的细胞中引入CDA应该可以抵消miR-484引起的表型。结果正如预料的一样，说明miR-484能够靶向CDA调控下游通路。

7. CDA表达可作为乳腺癌预后marker

   qPCR对30对样本检测，发现原发性乳腺癌比其配对癌旁中CDA表达频繁显著下调，而miR-484刚好相反。对193原发乳腺癌样本和36非癌control用IHC检测CDA蛋白水平发现CDA在94.4%非癌组织中有很强的信号，而在原发肿瘤中比例有所降低（40%）。此外，临床特征分析表明CDA与乳腺癌ER状态强烈相关。KM分析表明高CDA表达与长的DFS（disease-free survival）显著相关。此外，CDA高表达使乳腺癌复发风险降低。以上结果表明CDA表达水平可以作为乳腺癌的预后marker。

研究结论

   本研究阐述了乳腺癌吉西他滨抗药性的分子机制以及乳腺癌细胞中miR-484/CDA可以调节细胞周期。阐述了miR-484调控CDA在调节吉西他滨抗性和细胞周期、细胞增殖中的重要作用，且CDA可以作为乳腺癌预后的marker。

原文出处
Fu-Gui Ye,Chuan-Gui Song, Zhi-Gang Cao,Chen Xia, Dan-Na Chen, Li Chen, ShanLi, Feng Qiao, Hong Ling, Ling Yao, Xin Hu, and Zhi-Ming Shao. Cytidine Deaminase Axis Modulated by miR-484 Differentially Regulates Cell Proliferation and Chemoresistance in Breast Cancer. Cancer research 2015, 75, 1504-15.