STELLARIS首秀-多重拍摄解锁SARS-CoV-2致病机制
2020-11-30 来源:徕卡显微系统 张觉超 点击次数:5831今年6月，徕卡共聚焦新产品STELLARIS在上海启动了国内首秀，随后开启了其在全国多地的巡展。上市巡展还没结束，STELLARIS用户群中的首篇研究论文就已悄然成稿。该研究由法国巴斯德研究所的病毒学家Lisa A. Chakrabarti团队完成，聚焦在当下全球热点——SARS-CoV-2的致病机制。接下来，我们就来聊聊这篇题为“SARS-CoV-2 infection damages airway motile cilia and impairs mucociliary clearance”的文章[1]，顺便看看作者用到了哪些STELLARIS共聚焦的拍摄“技能”。
研究概览
SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2, 又称新型冠状病毒或COVID-19）病毒的“爆发”无疑是2020年的头号国际公共卫生紧急事件。研究表明，SARS-CoV-2病毒比2002/03年的非典病毒（SARS-CoV-1）具有更高的有效传播率，对人类健康构成了重大威胁[2]。SARS-CoV-2感染早期阶段上呼吸道上皮细胞中病毒的活跃复制是导致其高传播率的主要原因之一[3]。对SARS-CoV-2患者的尸检结果显示，病毒主要在上下呼吸道上皮和肺泡中复制[4] 。
目前，我们对SARS-CoV-2感染影响上皮细胞功能的机制知之甚少。为了揭示SARS-CoV-2从上呼吸道向肺深部扩散的致病机制，作者在人支气管上皮体外重建模型中研究了SARS-CoV-2与其主要靶细胞的相互作用方式，分析了SARS-CoV-2感染引起细胞的超微结构和功能变化。研究结果表明SARS-CoV-2感染早期会引发气道上皮结构中纤毛层（Ciliary layer）的破坏，致使纤毛运动能力减弱，导致黏膜纤毛（Mucociliary）局部清除障碍。局部纤毛的损伤可减缓病毒向咽部的运输，增加其进入支气管系统更深区域的几率，直到进一步感染肺泡并引发肺细胞的损伤。
呼吸道上皮
呼吸道上皮主要由3种细胞（杯状细胞、纤毛细胞和基底细胞）组成（图1），在机体抵御感染时发挥着关键的作用。其中，杯状细胞（Goblet cells）可以分泌一种保护性黏液（mucus），能够捕获吸入的微粒（包括微生物）。而纤毛细胞（Ciliated cells）的数量最多，占上皮细胞的一半以上，因每个细胞顶端约有200根纤毛而得名。纤毛细胞顶端的纤毛以一种协调的方式有节奏地摆动，导致其表面的黏液层持续地向喉咽方向移动，最终被吞咽[5]。这种黏液纤毛清除的机制能有效阻止吸入的微粒在肺部的积聚。基底细胞（basal cells）位于呼吸道上皮基底膜附近，在上皮损伤的刺激下可以增殖并分化为其他类型的上皮细胞。
图1 呼吸道上皮模式图
研究过程
研究围绕SARS-CoV-2对呼吸道上皮的感染过程展开。作者选用人的呼吸道上皮体外重建模型（MucilAir™模型，EPITHELIX公司）进行研究（图2A）。支气管上皮细胞在空气/液体界面（ALI）分化了4周后，作者通过扫描电镜确定了模型中支气管上皮细胞分化为假复层上皮，包括杯状细胞、纤毛细胞和基底细胞三种主要的细胞类型（图2B）。随后，作者用SARS-CoV-2病毒悬液（106pfu/mL）感染重建的上皮组织4小时并监控病毒RNA、TCID50（半数组织培养感染剂量）、细胞紧密连接、TEER（跨上皮电阻）等指标，最终确认从病毒感染到组织损伤后部分恢复病毒清除能力的时间窗口为7天（详细结果见论文原稿）。
图2 呼吸道上皮体外重建MucilAir™模型
A，模型示意图；B，分化4周后透射电镜检测图。
随后，该STELLARIS出场了，作者检测病毒感染的主要细胞为β-tubulin阳性的纤毛细胞（图3A）。利用共聚焦显微镜对假复层上皮的纵向扫描结果显示SARS-CoV-2对纤毛上皮细胞有优先的趋向性（图3B）。随后的电镜结果也显示SARS-CoV-2病毒对纤毛层有很强的破环作用（图3E、F）。
图3 SARS-CoV-2感染导致运动纤毛丧失
A，SARS-CoV-2感染后2天纤毛层共聚焦检测结果（β-tubulin标记纤毛细胞，spike标记病毒颗粒）；B，SARS-CoV-2感染后4天假复层上皮共聚焦XZY扫描结果（Cytokeratin-5标记基底细胞）；E & F，扫描电镜图像。
为了进一步确认SARS-CoV-2病毒破坏纤毛的机制，作者通过共聚焦进行了感染前后纤毛微管远端/近端峰值比率的测定（图4A、B）。结果显示，SARS-CoV-2病毒感染两天后纤毛通常呈现出缩短和畸形，其微管信号的远端/近端峰值比显著低于未感染的细胞。透射电镜的结果显示，SARS-CoV-2感染通过诱导轴突（Axoneme）的丢失和基底小体（Basal body）错位破坏原有的纤毛结构（图4E-H）。
图4 SARS-CoV-2感染导致纤毛结构破坏
A，纤毛层共聚焦XZY模式图像和荧光定量分析结果（β-tubulin标记纤毛细胞，spike标记病毒颗粒）；B，纤毛β-tubulin远端/近端峰值比统计图；E-H，透射电镜图像（其中bb: basal body; ax: axoneme; rt: rootlet; vp: viral particles; lp: large particle）。
接下来，作者用时间序列拍摄检测SARS-CoV-2感染对上皮体外重建模型微粒清除能力的影响（图5A、B）。结果显示，SARS-CoV-2感染不仅影响纤毛摆动的方向（图5C、D）和速度（图5E），还影响纤毛摆动的协调性（图5F，径直度）。换句话说，SARS-CoV-2感染导致的纤毛损伤能显著降低呼吸道上皮的黏膜纤毛清除能力。
图5 SARS-CoV-2感染导致纤毛丧失黏膜纤毛清除能力
微球在纤毛层运动轨迹图（A & B）、方向和幅度分析图（C & D）、平均速度统计图（E）以及径直度统计图（F）。
最后，作者在体外（上皮重建模型）和体内（金黄色叙利亚仓鼠模型）研究中对SARS-CoV-2感染后的呼吸道应激修复能力进行检测。结果显示，感染7天后上皮重建模型中基底细胞的密度增加，部分向纤毛细胞转变（图6A-C），培养体系内IFN表达水平上升（结果见论文原稿）。说明SARS-CoV-2感染可触发上皮防御和修复机制。在金黄色叙利亚仓鼠模型中，基底细胞的形态转变则跟SARS-CoV-2感染时病毒的计量正相关（图6E）。至此，作者根据研究得到的结论和已有研究成果推定：SARS-CoV-2感染后固有的上皮防御和修复机制可能发生得太晚，来不及阻止病毒在呼吸树（Respiratory tree）中的传播和继发性感染的发生。
图6 SARS-CoV-2感染后基底细胞参与上皮组织损伤修复
A，SARS-CoV-2感染后7天假复层上皮共聚焦XZY扫描结果（β-tubulin标记纤毛细胞，spike标记病毒颗粒Cytokeratin-5标记基底细胞）；B & C，沿Z轴定量细胞角蛋白-5密度分布和统计图；E，金黄色叙利亚仓鼠气管组织共聚焦图像（感染后4天）。
STELLARIS“技能”盘点
下面我们来盘点一下研究过程中作者用到了STELLARIS的哪些技能：
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XZY（正交视图）模式。坐头把交椅的就是XZY拍摄模式，即正交视图（orthogonal view）拍摄模式。作者要呈现支气管上皮组织中三种细胞的分布情况，而XZY模式下能采集得到样本正交视图（XZ方向的图像）。所以，文中几个关键的图像数据作者给出的都是XZ图像。另外，在STELLARIS上，我们可以很方便的利用XZY模式实现样品焦平面的精确定位。
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多色高清图像采集。同时将微管蛋白、病毒颗粒、角蛋白和细胞核在一张图片上展示，让读者直观看到3种细胞的位置分布，作者就是应用了共聚焦的多色成像能力。而STELLARIS的多色成像能力远不止于此。机器标配的HyDS高灵敏检测器，检测范围覆盖410-850 nm发射光波段，在传统的4色检测实验设计上，可以轻松扩展到6色。而双重制冷的加持更是让HyDS检测器能轻松应对超分辨率高清成像的需求。配合STELLARIS标配的Lightning超分辨模块，能帮助我们实现XY方向120nm、Z方向200nm的多色超高分辨率成像。
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XYT（时间序列）模式。在STELLARIS上也能轻松追踪细胞、囊泡或颗粒的运动轨迹。用户不仅能通过图像分析功能得到运动轨迹图，还可以通过DSE（动态信号强化）技术得到信噪比和清晰度好的图像。
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Navigator（导航式拼图）模块。想在展现样本全貌图像的同时得到清晰的单个视野图像？Navigator了解一下。集拼图拍摄和图像无缝拼接于一身，微观到宏观一览无余。配备FocusMap功能，拍摄范围再大都不“失焦”。
虽然文中没有用到，但不能不提STELLARIS的独门“技能”——TauSence模块[6]。在徕卡多个专利技术的加持下，STELLARIS成功实现将荧光寿命维度引入共聚焦成像平台。与传统共聚焦相比，STELLARIS能帮助您多一个维度获得样品图像、轻松避免串色、进一步扩展多色实验设计（基于荧光寿命）、实现样品组分拆分……优点实在太多（详细资料敬请回顾徕卡显微系统公众号往期文章）。
结语
应用STELLARIS的研究论文秀才刚刚拉开帷幕，后面STELLARIS会为大家展示更加丰富的成像“技能”，帮助用户“Get Closer to the Truth”！徕卡STELLARIS共聚焦显镜接下来还会继续举办全国范围内的上市巡展，欢迎大家前来体验STELLARIS的“十八般武艺”。
参考文献：
[1] Rémy Robinot, Mathieu Hubert, Guilherme Dias de Melo, Françoise Lazarini, Timothée Bruel, Nikaïa Smith, Sylvain Levallois, Florence Larrous, Julien Fernandes, Stacy Gellenoncourt, et al. (2020). SARS-CoV-2 infection damages airway motile cilia and impairs mucociliary clearance. BioRxiv.
[2] Petersen, E., Koopmans, M., Go, U., Hamer, D.H., Petrosillo, N., Castelli, F., Storgaard, M., Al Khalili, S., and Simonsen, L. (2020). Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infect Dis.
[3] Zou, L., Ruan, F., Huang, M., Liang, L., Huang, H., Hong, Z., Yu, J., Kang, M., Song, Y., Xia, J., et al. (2020). SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. N Engl J Med 382, 1177-1179.
[4] Hou, Y.J., Okuda, K., Edwards, C.E., Martinez, D.R., Asakura, T., Dinnon, K.H., 3rd, Kato, T., Lee, R.E., Yount, B.L., Mascenik, T.M., et al. (2020). SARS-CoV-2 Reverse Genetics Reveals a Variable Infection Gradient in the Respiratory Tract. Cell.
[5] Spassky, N., and Meunier, A. (2017). The development and functions of multiciliated epithelia. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 423-436.
[6] Application Note. (2020). TauSense: a fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat Method.