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细胞探秘之旅-徕卡多维度解析细胞生命活动直播回放

2021-04-30     来源:徕卡 赵梦路     点击次数:609

分离的人类胰岛的三维重建:绿色的胰岛素(AF488),红色的胰高血糖素(AF555),洋红色的IL-17 (AF647)和蓝色的细胞核(HoechstCourtesy Prof. Von Herrath, San Diego, CA (USA)
 

细胞是生命的基本单位,细胞生物学是研究细胞结构和功能的学科。细胞生物学研究热点主要聚焦在细胞内部结构、细胞信号通路、细胞器功能和结构解析、能量代谢和表观遗传等方面,细胞生物学研究难点在于细胞是非常精密且微小的单位,而观察设备存在空间、时间以及分辨率上的限制。
 
随着显微镜和染色技术的改进,科学家们能够看到越来越多的细胞内部细节。范·列文虎克使用的显微镜可能把标本放大了几百倍。今天,高分辨率荧光显微镜可以在微米及以下范围观察细胞器的形状,借助活细胞工作站可以将细胞的生命活动完整记录下来;通过激光扫描共聚焦显微镜,可以对细胞进行三维光学切片成像,使研究人员能够生成细胞的详细三维图像;利用STED纳米显微镜可以探究细胞器内部结构、离子通道的亚基甚至分子水平的精细结构信息……想要充分扩展自己的研究成果并获得高质量的数据,选择合适的显微成像方法至关重要。
  
细胞生物学研究痛点
研究目标 特点 成像痛点
细胞器(线粒体、中心体等)
细胞骨架(微丝微管等)
其他微小结构(细菌、真菌)
细胞膜
细胞核内微小结构
结构非常小,常规分辨率无法实现精细观察 受衍射限制传统成像分辨率不够,成像结果结构不清晰;
定位不精确
活细胞快速成像 活细胞长时间稳定成像;
结构小,运动的细胞,信号较弱
活细胞成像速度、分辨率和稳定性不够;
弱信号采集不到;
宽场分辨率不够
活体动物(斑马鱼、小鼠、大鼠)
器官、类器官等
在体细胞水平研究,需要多色深度成像;
功能成像(代谢、微环境等)
多色成像不灵活,操作复杂;
传统FLIM速度慢,费时
细胞操作
光操作,细胞消融
细胞分离切割精准取材
细胞到电镜联用
精准的细胞操作,漂白,消融快速成像;
分离单细胞或染色体
电镜观察的局限
速度慢,无法漂白,不能做细胞切割;
光镜到电镜有路线障碍
 
 
细胞精细结构解析解决
  • STED纳米显微成像技术

 
STED是基于STELLARIS共聚焦平台纯光学超高分辨技术,结合快速荧光寿命采集系统实现XY轴30nm分辨率极限。同时运用FLIM Phasor技术可显著降低STED激光能量,适用于活细胞超高成像。TauSTED特别适合应用于组织和细胞内微小结构和物质的观察,如膜蛋白与膜微结构域、细胞器内部的微小结构观察、细胞骨架结构、神经元突触研究、细菌内部的物质结构研究、病毒学研究、蛋白复合物研究等等。
 
借助STED技术揭示核孔复合物结构

STED揭示不同状态下线粒体膜融合过程
  
  • DMi8 Infinity TIRF
TIRF(全内反射荧光显微镜)主要应用方向:细胞膜成像、囊泡运输、单分子示踪、受体动力学变化/聚集、受体超分辨成像、体外蛋白研究、细胞骨架组装、胞吞胞吐、细胞粘附、细胞运动。
 
 
Hela细胞,使用Dil标记细胞膜(左图普通荧光显微镜,右图TIRF膜成像)
  
  • STELLARIS FALCON快速荧光寿命成像系统
STELLARIS FALCON是Leica最新的集成整合方案,将FLIM完美结合到STELLARIS共聚焦平台,实现快速FLIM数据采集。
 
目前,FLIM技术越来越多的应用到生物学研究中,常见的应用有测定分子相互作用FLIM-FRET,环境感知和组分分离等,在活细胞中典型应用就是利用FLIM-FRET研究活细胞分子相互作用。
 

 
排除荧光漂白和淬灭对FRET测定的影响,精准测量分子间相互作用强度。无需考虑acceptor荧光,实验简单。可进行离体活细胞和在体活细胞快速FLIM-FRET测量。
 
FLIM研究活细胞代谢
Fast FLIM image and FLIM phasor plot of U2OS cells labeled with Flipper TR, left cell in cell culture medium, right cell treated with 5% concentration glucose
 
 
活细胞解决快速成像
 
细胞是组成生命个体的基本单位,实时在线研究细胞的增殖、代谢、凋亡和应激反应,有助于了解细胞的生命规律,通过现象揭示生命本质。
 

THUNDER高分辨活细胞解决方案

C2C12细胞生长和迁移到双方transwell膜沾核纤层蛋白B(红色)核结构,赫斯特(蓝色)的DNA,和γpAX DNA损伤(黄色)。细胞成像使用THUNDER活细胞培养成像系统与63X/1.4油浸物镜。图片上面代表扩展景深预测厚17.47µm z-stacks。
图片由美国加州大学戴维斯分校生物科学学院神经生物学、生理学和行为系卢卡斯·史密斯博士提供。

 

STELLARIS Lightning

细胞生物学研究已经不再局限于细胞层面观察,而是聚焦于亚细胞器、染色体、离子通道等细小结构,传统宽场荧光显微镜虽然有成像速度快、光毒性低的有点,但是空间分辨率并不能满足对亚细胞器更精细结构解析的分辨率需求。Leica STELLARIS Lightning超分辨系统基于共聚焦平台,XY分辨率达到120nm,Z方向达到了200nm,超越了普通共聚焦光学极限。
 
Gatta Cell,细胞核-DAPI,线粒体-Tom20 Alexa488,Actin-Alexa555,Tubulin-Alexa635
Lightning超分辨成像

  
STELLARIS的每个检测器都是光谱式检测器,可以实现410nm-850nm光谱检测,配备独家的485-685nm或440-790nm白激光,谱线任意可调,满足染料最佳激发谱线需求。白激光和HyD检测器实现激发和发射光谱检测自由。STELLARIS共聚焦平台使用棱镜分光和狭缝检测,在任意波长都可以有非常高的分光效率,做到最大程度利用荧光信号。
 
STELLARIS多色成像
 

NE-115 cells. LifeAct-mNeonGreen (left: yellow, right: red), MitoTracker Green (left: yellow, right: green), NUC Red (left: gray, right: blue), and SiR-tubulin (left: gray, right: magenta)​.Courtesy: Max Heydasch, University of Bern and Spirochrome
TauSense时间分辨共聚焦成像系统
  
NE-115细胞同时标记了actin-mNeonGreen、Mitotracker Green、细胞核Red和SiR-tubulin共4种荧光染料,但由于LifeAct-mNeonGreen和Mitotracker Green的发射光谱高度重叠,NuC Red和SiR-tubulin的发射光谱高度重叠,所以在用常规共聚焦(左图)拍摄时只能体现出两种信号的差异。而在TauSeparation模式下(右图),基于平均光子到达时间AAT,我们使用一个检测器就可以同时将这两种发射光谱重叠的染料区分出来(LifeAct-mNeonGreen-红色,Mitotracker Green-绿色,Nuc Red–青色,SiR-tubulin–品红色),所以只需要使用两个检测器,就可以得到这幅没有串色的4色荧光图像了。
  
 
活体动物、类器官水平

STELLARIS DIVE光谱式多光子显微成像系统


4Tune – the world’s first and only spectral NDD
 


Blue: Astrocytes, Sulforhodamine;Green: Microglia, GFP;Yellow: Neurons, YFP;Red: Blood, Alexa680-Dextran
活体小鼠在体脑细胞多色成像

 
 

多光子FLIM在活体细胞水平研究药物靶向作用机理 

用FLIM-FRET研究药物对胰腺导管腺癌(PDAC)的靶向作用,实现了对肿瘤不同微区的单细胞反应的观察。
 

Conway JRW, et al. Cell Rep. 2018 Jun 12;23(11):3312-3326. 
Intravital Imaging to Monitor Therapeutic Response in Moving Hypoxic Regions Resistant to PI3K Pathway Targeting in Pancreatic Cancer
 

STELLARIS DLS光片成像

Leica STELLARIS共聚焦平台可以无缝升级light sheet功能,升级后一套仪器同时拥有完整的共聚焦和光片的功能。Leica DLS数字光片技术可快速实现双侧照明,具有光毒性低,成像速度快,适合3D成像的优点。DLS和双光子共聚焦搭配,可以实现定点损伤和快速光片成像相结合。

Movie courtesy of B. Eismann/C. Conrad at BioQuant/DKFZ Heidelberg
3D培养细胞光片成像
  
 
细胞操作
  • Leica DMi8 Infinity Scanner

Hela Cells expression paGFP-pB (histone marker). Courtesy Rebecca Smith, LMU, Munich.
  
Leica Infinity Scanner实现快速:
  • 激光切割、消融、解笼锁、DNA损伤
  • 光激活、光开关、漂白、光遗传
  • FRET受体漂白法等光学刺激实验
   
  • Leica DMi8 Infinity PLU脉冲激光模块
Infinity PLU应用:
  • 活细胞切割
  • 活细胞和细胞器消融
  • DNA损伤



 
 
 

MDCK cells, cutting;Sample Courtesy: Prof. Dr. Ralf Jacob, Marburg, Germany
 
  • 激光显微切割精准取材
Leica激光显微切割优势
1.正置镜平台,适合病理切片和活细胞样本切割;
2.明场和荧光实时切割,操作简单快速;
3.紫外激光切割,直接汽化,切缘平整不损伤生物大分子;
4.专利的激光束移动切割,切割精度可达0.07μm;
5.重力收集,简单高效,收集耗材成本低,实用高通量切割工具
  

 单细胞克隆制备
 
THUNDER Imager EM Cryo CLEM冷冻光电联用助力细胞超精细结构解析
 
传统光电联用受限于光镜分辨率,荧光数据在电镜下目标不明确,THUNDER Cryo-CLEM是冷冻光电联用专用设备,具有分辨率高可以精准识别细胞结构,在相关工作流程中平稳、安全传送坐标、图像和样本。
 

冷冻光电联用实验流程Cryo-CLEM / Cryo-ET
  
徕卡冷冻光电联用优势:
    冷冻光镜专用传输杆,更换样品方便
    传输杆液氮控温,确保样品安全转移
    有普通载网夹具和Auto grid夹具
    该流程中所有附件均由徕卡提供,避免第三方纷争
 
 
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