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8月23日19：00，由瑞沃德主办的最-新一期「大成学堂」直播课程活动如期开播。此次直播特邀南京大学张洋浔博士带来“膜片钳技术解析与经验分享”主题分享，倾囊相授膜片钳技术的理论知识和操作常见问题。张洋浔博士细致入微的讲解获得观众们连连点赞！

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直播开始，张洋浔博士详细介绍了膜片钳技术的发展历史及原理，紧接着以切身的实验室工作经验来分享膜片钳技术的整体系统组成及相应的操作步骤，助力大家构建对膜片钳技术的整体认知体系并了解每个必要步骤的重要作用。其中在介绍显微操作系统时评价“瑞沃德自主研发的显微操作系统，非常好用，容易上手”。

在第二部分，张洋浔博士通过结合所在课题组之前的研究工作，进行了膜片钳实验的一些经验分享，其中包括“观察宏膜电流，并研究某种代谢性受体的下游离子机制”、“quantal Excitatory Postsynaptic Currents(qEPSC)”等等。
 

在第三部分，张洋浔博士分享了各个实验步骤的注意事项，例如“如何进行玻璃微电极拉制”、“如何避免堵电极”、“如何排除干扰”等，引起评论区热烈地讨论。其中张博士赞叹“瑞沃德自主研发的微电极拉制仪，使用起来非常方便”。
 

在答疑互动环节，观众们纷纷提出自己在实验过程中遇到的问题，众多提问迅速刷爆评论区：“达不到G欧封接时应该排查哪些影响因素呢?”“单突触和多突触连接如何证明和区分呢？”“有哪些方法或操作可以避免记录过程中细胞合上?”……足见膜片钳技术在神经科学研究中的重要地位和科研小伙伴们对膜片钳技术不断求知和钻研的精神。张洋浔博士也不遗余力地为大家进行了解答，不仅在直播中在线解答了近20个问题，还在直播后，对其他未回答的问题进行了整理和文字回复。咱就是说，是不是超用心~
 

聊天区问题详解（文字版）

1、成像系统是用一般的显微镜吗？放大倍数是多少？
答：显微镜就是普通的正置显微镜，有些型号的显微镜自带放大一倍的功能。我们使用的低倍镜是5倍镜，高倍镜是40倍镜，常用镜头即可。此外不同的Camera和软件对图像处理的能力也不太一样，会影响视觉效果。

2、电流钳模式下如何维持膜电位稳定，可以分享一下经验吗？
答：这个一般状态比较好的细胞，它在电流钳模式下记录到的基线会很稳定，一些前期波动是因为电极内液交换所致，是正常的。如果该脑区存在自发放电，一般都能够记录到；有时候也有规律性的EPSP或IPSP，这也是正常的。如果你发现膜电位一直在动，并且从负值跑到0或者正值，可能就是细胞状态不对了，这也是一个正常的现象，没有什么好的办法可以操作；如果所有细胞都有这种现象，需考虑一下是否是电极内液有问题。此外，如果是一种周期性的浮动，考虑一下要把液面调稳，可能原因是出水口和进水口的压力不一致，使得液面波动，换管子或者清理管子都能解决。此外，如果膜电位浮动一些值能到稳定状态，可以用注射正或负电流方式，将细胞稳定在你一直进行实验的膜电位上，因为这也是文献描述的一种方法。

3、请问一般细胞的封接时间可以维持多久，如达不到常见维持时间可能有哪些影响因素呢？
答：如果是吉欧封接，一般成功后，稍过一会儿撤回正压，基本不会掉。当然得注意不能一直给负压，那会将细胞一直吸入电极里面，影响记录；如果是正常一个细胞能进行多久实验的话，其实状态非常好的细胞，包括各项设备和操作都正常，能记录不止2个小时。我曾经也请教师兄师姐，包括我自己也体会，就是遇到的那种状态特别好的细胞，印象非常深刻的细胞也就那么几个，当然它们的数据也都在文章中的raw data示例图里面；那其实我们能做的就是增加patch的次数，或者把关键实验提到细胞状态较好的前期来进行，因为细胞状态由好到不好，是一个客观存在的现象。

4、感觉脑片细胞破膜比培养细胞困难，有什么操作诀窍吗？
答：我本身使用的是用嘴吸的方法破膜，如果你用的是注射器破膜可以考虑尝试一下。就用1 ml注射器的外壳，嘴对着后面吸。但其实我觉得只要熟练操作，应该就没什么问题，但需要练习。两种细胞我都patch过，我觉得都没什么很离谱的阻止破膜的因素。另外如果是因为吉欧封接不正常所导致的吸破不成功，这也是正常的，还是需要吉欧封接的成功。此外玻璃微电极的口径很小的话，也会影响破膜，考虑用电阻3-5 MΩ的。

5、为了避免记录过程中细胞合上（串联电阻变大）破膜时或破膜后需要注意啥，或者有哪些特殊操作？
答：这个其实避免不了，咱们能做的就是长期监测膜电容电流的形状，如果变得矮胖了，Ra值变大了，我们就轻轻吸。当然有时候会把细胞吸掉，这也不用灰心，总之多做就能熟能生巧。从另一方面来说，关键实验还是得快点做，因为越往后面越难吸。

6、面对基线不稳。常见的原因有哪些？（记录电极充分镀氯，使用的也是商业化的参考电极）答：第一可能是液面波动较大所致，如果将记录模式放到I = 0模式，电极入水，观察一下记录信号是否是有一定周期性变化。这个时候就需要考虑将水流和液面调稳。第二，在patch完细胞以后，因为内液交换，导致基线变化是正常的，可以等稳定再进行实验，一般5 min左右可以完成。如果基线在长期一直变化（比如高于10 min），得考虑细胞状态的原因导致，这个时候不能犹豫，赶紧换下一个细胞。当然基线变化在小范围内，其实都可以接受的。

7、 如何判断steady state呢？
答：上述一些问题问了细胞基线不稳定的状态下怎么去调回稳定状态。如果是指机器稳定状态的话，我觉得就是没有非常异常的干扰信号被你所记录下来。如果有异常或者交流样变化的电信号，就需要排干扰；如果是指细胞稳定状态，就得看whole-cell recording状态下，这个基线有没有异常的波动。一般吸破细胞，由于内液交换，会使得基线变化，但是会稳定在一个值上；除此之外的基线波动，需要看看会不会对你记录的电信号造成直接影响，再按照推理的方式进行排除。细胞状态由好变为不好，其实也都属于正常的，我们需要多patch，才能做完一个实验。

8、电极拉制后需要再处理电极吗，例如酒精浸泡、超声清洗之类的？
答：其实是很必要的。酒精浸泡、超声清洗应该发生在拉制电极之前，对所有的毛细玻璃管进行该操作。之后拉制完电极，需要抛光这个操作，让尖端更光滑，更易封接。如果有设备的话，可以进行抛光操作；如果没有的话，使用直接拉出来的玻璃微电极也可以。如果你买来的玻璃微电极拆开后非常干净，其实就可以直接使用，之后要横向保存在一个密闭环境，减少灰尘影响。长期暴露的这种玻璃毛细管，就需要酒精浸泡、超声清洗这些步骤。

9、每次换加热片后拉制参数都要重新调试一遍吗？
答：是的，都得跑一次ramp test或者软化点测试（瑞沃德公司拉制仪），看看这个温度点和你之前参数设置的大不大，不大的话就可以继续使用原参数拉一根电极，看看口径变化大不大。如果变化不大，可以依然使用原参数；如果变化很大，就得用测得的这个软化点或者ramp test温度来重调参数。

10、ACSF用前必须要校正pH吗？
答：ACSF里面其实含有缓冲系统，外源性添加的东西一般不会影响整体。文献中都说pH 维持在7.2 ~ 7.4，只要照着他们给的配方配制，用正常纯水或者双蒸水，不太会出问题。如果你们是用母液保存，使用的时候稀释的方式进行ACSF配制，这就需要对母液pH进行调节，然后对稀释后的ACSF进行pH评估，看pH会不会受到影响，心里得有个数。我使用的ACSF是现配现用，之前用pH计测过一次，其实在7.2左右，后面也就没再测。只要实验条件不变，一般不会造成pH很大影响。

11、成年鼠取脑片不灌流影响很大吗？
答：其实非常大。① 因为有血的话，本身会对你的脑片透光性造成影响；② 其实并不是说，不灌流就会导致patch不上细胞，不灌流可能会导致你切出来的脑片死的速率加快；你可能前几张脑片能patch细胞，并也能记录，但是后面脑片状态容易很快变得不好。此外，细胞的活力本身也会受到影响，容易状态不好。我之前遇到过的就是没灌流好，结果在我那个脑区就看不见细胞。这里可以推荐你去jove上搜索patch clamp成年脑片制备相关的资料，他们做了对比，并且也描述目的是减少脑片受到缺氧的影响。

12、我们实验时发现微操的操作柄会引入很大的噪声，不知道老师有没有相应的建议呢？
答：看看干扰是不是交流电，是的话就考虑用使用接地的方式，将其和这个膜片钳防震台一起接地，并且用锡纸给它包一层，看看能不能解决。如果是使用过程中会有相关的电流信号产生，就看看能不能用减少摩擦的方式。此外，还可以尝试通过调low pass 或high pass看看能不能滤去这个噪声。

13、请问老师patch浦肯野细胞对于比较深的细胞您会去做吗？我感觉正压不能很好的吹干净细胞表面。我的切片厚度是250um。做太深的细胞电极很容易堵。还有您在封接浦肯野细胞的时候holding是一步到位吗？
答：我做的是成年浦肯野细胞，并且矢状切，因为冠状切不太容易区分相应分区，而且我个人觉得得到的浦肯野细胞层不规则，影响视觉效果。此外，我patch过表面的和它后面一层的浦肯野细胞，因为胞体巨大，下电极一般不能再把深层的浦肯野细胞暴露得很清楚。250 μm切片可以的，电极堵住可能并不是因为下的深，是因为正压太大把脏东西吹出来了，应该注意电极内液污染的事项。封接浦肯野细胞需要慢慢的holding，我这边从0 mV开始，按照Δ -10 mV的变化直到钳制目的电位，在每个电位变化下稳定几秒就行。我在封接时，用普通钾离子内液的确很难瞬间吉欧封接，需要耐心等一会儿。

14、小白一枚，请问有没有推荐的入门书籍呢？
答：推荐刘振伟老师的《实用膜片钳技术》；陈军编的《膜片钳实验技术》。书中所描述的许多偏向物理，可以选自己能理解或者需要了解的去阅读。另外有机会的话，还得去相关实验室去学习，手把手教学我个人还是觉得挺必须的。

15、请问我的细胞破膜后IV刺激总掉或者不易破膜，是什么情况？
答：如果电流刺激或者电位变化过大，的确会造成细胞状态不好。但是重要的实验还是得多做，总有稳定的细胞被patch并被记录到。有时候一个细胞就跑一个protocol的实验也可以，并不需要每个细胞都把所有实验的protocol都跑完。不破膜可能就是玻璃微电极电阻过大，口径小。这种电极易于封接但不易吸破，考虑换口径大一点，又和你目标细胞相对合适的玻璃微电极进行patch。

16、请问记录sIPSc时有的使用普通K内液，钳制0mvundefined  看文献中类似的脑区细胞，有的用含Cs内液-QX314，也是钳制0mv ，会影响记录结果吗？
答：在记录sIPSC时，如果钳制在0 mV，用的内液钾成分是K-methylsulfate （140 mM）。如果钳制在静息电位下，用的可以是K+内液，但是成分为KCl （135 mM），同时也是高氯的，一般老文献会用这种配方；另外就是CsCl（110 mM）内液加QX 314来阻断动作电位和K+通道。一般情况下建议，对于同一个课题内的实验，不要改变内液的种类；更不能改变钳制方法，因为两种钳制方法下的电化学梯度力不会完全一样。

17、请问原代神经元为什么老是测不到诱发动作电位？
答：我本身没做过相关实验，但是我猜测原因可能是：①取原代神经元应该在鼠幼年未发育阶段，这个时候本身细胞的电活动就不会太强。我个人在幼鼠脑片上也不会很容易记录到AP，基本上在成年动物上才能稳定记录到；②你做的是原代细胞，也不是幼鼠的急性脑片，这就会导致细胞周围的环境势必受到影响，也是不可忽视的因素。这个难度还是肯定有的，需要看看文献的方法，借鉴别人用了什么特殊的内液或外液。

18、请问怎么确定自己吸住的是自己想要的单个通道呢？能介绍一下单通道记录的经验吗?
答：我没有做单个通道的实验。看别人文献如果在脑组织细胞中分离某种通道的电流，也是在whole-cell recording下，用其他通道的阻断剂以及可以激活该通道的电位protocol来分离该种通道的宏膜电流。在历史上做单个通道实验的时候，的确会有你提的这个问题，解决方式可参考以下，在爪蟾卵母细胞上仅表达你目标通道的基因，这样你patch的膜上就仅有你这个通道蛋白，不会有别的通道；还有一种用人工的方法将离子通道和人造的脂双层混合，形成脂质体进行实验。

19、请问膜片钳注入的反向电流与平衡的电流时差有多少？注入的电流会否对细胞内部离子的改变，影响后续的电生理记录？
答：这个时差可以忽略不计的，假设你一次记录有多个突触传递信号，这些信号都和实际存在时差，所以相对而言这些突触传递信号本质是连续的。电压钳模式下，注入电流的目的是为了抵消某个钳制电压下的跨膜电流，所以对于细胞来说，它胞内和胞外的电荷没变；Ag/AgCl电极以及电极内液势必会改变胞内离子成分，这是客观存在的，但对你记录到的电信号来说不会有任何影响。但需要知道电压钳状态下的细胞已经不是生理情况下的状态，因为它的膜电位被钳制住，不会再变化了。

20、分析曲线各种数据处理用什么软件比较好呢？
答：平常还是用的Clampfit。对于突触传递事件，我师兄和师姐推荐用mini analysis。

21、请问老师做场电位吗，想请教一下可以刺激出EPSP，但是诱导不出LTP是为什么呢？
答：能记录到fEPSP就说明整个系统没什么问题。诱发不出LTP来的原因可能是细胞状态不太好。具体的话可以考虑这几个方面：① ACSF通氧需要很充足；②电刺激调小一点，因为长期记录时，每20 s或30 s就要给一次电刺激，过大可能会导致突触前递质消耗大于补充，可以参考文献确定用多大的电刺激。此外LTP实验还是得多做，找到LTP表型明确的细胞。如果是别的没有报道的脑区，LTP诱发实验可能更难诱发出来，但如果别人报道有，还是得增加信心一定能做出来。

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