随着国家药品监督管理局批准了一批 AAV 制剂的临床试验申请，越来越多的 AAV 制剂进入大众视野。AAV 制剂中病毒滴度的准确定量，是影响疗效的关键因素。因此建立准确、稳定的检测流程对于细胞和基因治疗企业来说尤为重要。数字 PCR 作为新一代的核酸定量工具，以其绝对定量与精准性高等特点，被细胞和基因治疗行业快速接纳并应用。
  腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一类单链线状 DNA 缺陷型病毒，需要辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制。在基因治疗的研究中，通常使用不需辅助病毒的重组 AAV 病毒（rAAV）将目的基因序列插入 rAAV 表达质粒中，包装病毒，然后直接使用 rAAV 感染细胞就能完成目的基因的插入操作。rAAV 作为基因疗法载体有以下优势：安全性高、免疫原性低；宿主细胞范围广；扩散能力强；体内表达基因时间长；适用种类多样等。
 
腺相关病毒 AAV 的检测
AAV 制剂的滴度检测是生物企业中重要的环节，稳定及精确的检测结果是临床给药的基础保障。根据现有的检测手段及原理，可以将其分为物理滴度及感染滴度两大类型。物理滴度主要是指病毒颗粒滴度及基因组滴度，感染滴度主要指目的基因的转导滴度。
 
物理滴度目前的主流方法是荧光定量法（qPCR），但 qPCR 往往由于其本身的技术原因，不同批次试剂中不同的标准曲线会影响其对最终浓度的计算，导致最终的滴度计算有所偏差。
 
达普生物提供一种更精准的检测方案 —— 微滴式数字 PCR，可以直接量化 DNA 拷贝数。这种方法具有以下特点：
 
1. 绝对定量：无需标准曲线，直接定量目的序列，减少实验复孔及标准曲线带来的额外操作和实验误差。
2. 更加准确：与 qPCR 相比，数字 PCR 可以消除不同 PCR 反应扩增效率的不同引入的定量偏差。
3. 更加精确：实验重复性好，实际样品测试结果 CV＜15%；且不受人为因素影响，在不同实验人员操作的情况下，结果均显示较小差异。
 

	qPCR	数字 PCR
定量能力	依赖标准曲线，相对定量	绝对定量
精准度	好	极佳
重复性	好	极佳
抑制剂耐受情况	一般	较好
数据分析	人工划定阈值	仪器自动分析

 
正是由于以上优点，美国药典章节 “US Pharmacopeia Standards for Cell and Gene Therapy” 中，对 AAV 制剂的滴度测定推荐了数字 PCR 方法用于替代 qPCR 方法。  
达普生物 AAV 病毒核酸滴度检测套装
为推动 AAV 病毒滴度更加精准定量，助力 AAV 制剂疗法的深入研究。近日，达普生物基于星云数字 PCR 平台，自主设计开发了 “腺相关病毒（AAV）滴度检测试剂盒（数字PCR法）”。达普生物的星云数字 PCR 平台搭配本试剂盒，为客户提供从病毒制品准备到结果导出的完整解决方案，可应用于 AAV 生产制造中的质量控制。
   
达普生物-腺相关病毒（AAV）滴度检测试剂盒优势：

• 操作简便：无需标准曲线，试剂盒利用率高。
• 兼容性好：适合多种血清型检测。
• 准确性好：具有较好的灵敏度、特异性，不受部分序列二级结构影响。
• 性价比高：数字 PCR 方法与 qPCR 方法实际耗材成本相似。
• 优化流程：部分制品可使用免提取策略直接检测培养物中的病毒滴度。

 
数字 PCR 定量检测无需标准曲线
● 低浓度重复性较好
 
qPCR 定量检测需要标准曲线
● 多批次，样品少的检测环境需要重复多次标准曲线
● 标准品需要稀释，操作要求较高，重复性（尤其是低浓度）欠佳
 
达普生物数字 PCR 系统软件合规性 
为满足企业客户需求，达普生物数字 PCR 分析软件 - Astrolabe 合规版软件系统功能符合 FDA 21 CFR Part 11 法规，经检测保留的数据可作为检验后追溯的有效数据来源，确保生物医药企业生产、质控中数据记录的合规性。
 
参考文献：
1. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery；Nat Rev Drug Discov. 2019 May ; 18(5): 358–378. doi:10.1038/s41573-019-0012-9.
2. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR；Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr 1; 25(2): 115–125.Published online 2013 Dec 12. doi: 10.1089/hgtb.2013.131
3. https://en.wikipedia.org/wiki/
 
  达普生物科技有限公司孵化于香港科技大学，于 2018 年由多位海归博士共同创立。在深圳、嘉兴、香港三地设有研发中心，研发团队近百人，建立了集微流控芯片、仪器及试剂生产为一体的 GMP 厂房。
 
公司专注于将液滴微流控技术应用于精准医学领域，致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂的研发和生产于一体的完整解决方案提供商。公司自主研发、生产三大技术平台：高通量筛选系统、数字 PCR 系统和单细胞组学系统，应用于高通量药物质检、抗体筛选、生物制品质检、癌症研究、癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断和病毒定量检测等领域。
 
更多产品 ●彗星高通量筛选系统
1. 基于荧光标记及电介泳效应推动分选，无损伤；
2. 接驳星海单细胞建库系统，提高建库质量并降低测序成本；
3. 接驳星云数字 PCR 系统，筛选阳性液滴，富集微量靶标 ，降低测序成本；
4. 快速单克隆抗体细胞株或转染阳性单细胞筛选。
  ●星云全自动数字PCR系统
1. 专利压力不敏感液滴生成技术：液滴生成大小均一，扩增更稳定；
2. 3.5 分钟内可同时处理 1-32 个样本：上样灵活，满足高通量需求；
3. 液滴可回收，接驳彗星高通量筛选系统，后续用于测序或目标基因检测。
  ●星海单细胞建库系统
1. 采用独家开发的水凝胶编码微球和液滴微流控技术，性能优越；
2. 针对不同细胞数、种类及上样量，1-4 通道，灵活调整，使用更加方便；
3. 流程灵活，可以接驳下游流程。
 
 达普生物ThunderBio
达普生物科技有限公司致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂、耗材研发生产一体的完整解决方案提供商。自主研发生产的两大技术平台：数字PCR和单细胞组学系统。产品适用于癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断、病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选等领域。