IPHASE/汇智和源于2023年2月20日于北京总公司举行了本年度第二场研讨会，在IPHASE/汇智和源技术总监的指导下，就外周血单个核细胞（PBMC）制备方法及注意事项与大家进行了探讨。

IPHASE/汇智和源顺应药物开发和免疫学研究等的需求，不断优化PBMC的提取工艺，形成了各种属高质量的PBMC产品，如人PBMC、猴PBMC、犬PBMC、大鼠PBMC、小鼠PBMC、猫PBMC、小型猪PBMC、兔PBMC等。根据客户的使用要求和习惯，我们可提供新鲜分离和液氮冻存两种形式的PBMC产品，客户可根据实际需求和产品自身特性选择并订购满足要求的产品。新鲜分离的PBMC可很大程度的保留PBMC中稀有细胞的占比，但货期相对较长，试验时间需根据提取时间调整；液氮冻存的PBMC复苏存活率可达90%以上，基本可满足大部分客户的需求，随用随取，可任意安排试验时间，但冻存难免会对细胞造成一定的损伤，如需研究稀有细胞难免会对试验结果造成一定干扰。

一、外周血单个核细胞（PBMC）

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）是外周血中具有单个核的细胞，是白细胞（WBC）的一个子集，白细胞是机体免疫系统对抗疾病的组成部分。PBMC主要由淋巴细胞（T细胞、B细胞和NK细胞）和单核细胞组成，通过密度梯度离心从外周全血中分离。PBMC被广泛应用于药物发现/开发、分析验证/开发和其他免疫学相关研究中。

Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3+T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。 二、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法

1.设备与试剂
全血 （以10ml为例）
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培养基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒

2.方法/步骤
配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
  （1）在离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll
（2）取抗凝外周血（全血）与无菌PBS按照1:1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1:1:1。
（3）水平离心400g×30分钟（可根据淋巴细胞分离液Ficoll或离心机转子要求调整）
（4）离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，主要就是单个核细胞，包括淋巴细胞与单核细胞。此外，还含有血小板。
（5）去除部分上层液体，余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
（6）末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适当增减时间。
（7）加入10mLPBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
（8）末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。

三、注意事项

全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置低水平的制动。否则将分层混乱。

四、细胞运输与保存

（1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏；
（2）T25瓶运输细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。

五、PBMC收到后注意事项：

（1）收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。
（2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。
（3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。
（4）贴壁细胞：若细胞密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，收集细胞瓶内的培养基，留8ml继续培养至80%左右再传代，瓶盖可稍微拧松。
（5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后4℃保存备用，可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。
（6）细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。

六、IPHASE产品特点

l  来源清晰

IPHASE/汇智和源生产PBMC所用血液均由正规生产商采集，进口的人PBMC产品均有伦理和知情，免除了后顾之忧。

l  产品安全  

IPHASE/汇智和源PBMC生产所用动物均经过传染源检测，使用更安全、更放心。

l  纯度高

IPHASE/汇智和源的PBMC产品均根据种属特异性使用专用分离液进行提取，产品纯度高。

l  活性好

IPHASE/汇智和源的PBMC产品复苏活性较好，可达90%以上。

除此之外，IPHASE/汇智和源可根据客户特殊需求，提供不同种属和特殊种属动物PBMC产品的定制服务和人PBMC产品的进口服务，望广大科研工作者来电咨询。
 
关    于    我    们

汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。