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高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法

2013-09-25     来源:本站     点击次数:7026

高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法
王慧娜   初志战   马兴亮   李日清   刘耀光*
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 / 华南农业大学生命科学学院，广东广州510642
 
摘  要：制备大量生物样品的模板DNA用于PCR检测是费时费人工的工作。本文介绍一种高通量的植物基因组DNA(gDNA)快速制备及其用于PCR基因型检测的操作方法。将一小段单子叶植物苗叶片(长度约30 mm或40 mm，与96方孔板的孔深大致相同) 或一小块(约2~4 mg)双子叶植物叶片放入96方孔板的各孔中、放入一粒钨合金珠和150 µL制备缓冲液，盖好硅橡胶盖，在涡旋器振动3~5 min破碎组织。用96针复制器(或多通道移液器)转移每样品约0.5~1 µL此粗制gDNA溶液(含有2~3 ng gDNA µL-1)到96孔PCR板的反应液中，适合用各种类型的PCR标记(如简单序列重复SSR，插入缺失InDel等)进行基因型检测，或较大的DNA片段(>1 kb)的扩增，可以得到良好的效果。本方法的关键是控制合适的破碎叶片量与制备溶液量比例(约2~5 mg, 但不超过10 mg 150 µL-1溶液)，以及不要加入过多量的gDNA(不超过PCR反应液量的1/10)，以免带入过量的杂质抑制PCR。因此，这种从种植材料，制备gDNA, 转移样品gDNA，到PCR都是96格式化操作的高通量、低成本方法适合于大量植物样品的规模化的基因型检测。
关键词：基因组DNA制备；PCR；基因分型
 
A High Through-Put Protocol of Plant Genomic DNA Preparation for PCR
WANG Hui-Na, CHU Zhi-Zhan, MA Xing-Liang, LI Ri-Qing, and LIU Yao-Guang*
State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources; College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China  
 
Abstract: Preparation of large numbers of plant genomic DNA (gDNA) samples for PCR in basic researches and molecular breeding in crops is a time-consuming and laborious work. In this study we developed a protocol for rapid and high through-put preparation of plant gDNA for PCR. A piece (about 30 or 40 mm in length, the same as the depth of the used 96-deep well plates) of rice (or other monocot plants) seedling leaf, or about 2-4 mg of dicot plant leaf tissue, was put into each well of 96-deep well plates. After adding a tungsten bead and 150 μL buffer (10 mmol L-1 Tris (pH 9.5), 0.5 mmol L-1 EDTA, 100 mmol L-1 KCl) in each well, the plates were sealed with silicon rubber caps, and vigorously shaken with a vortex shaker for 3–5 min, followed by a brief centrifugation for a few seconds. For the pieces of monocot seedling leaves (30 or 40 mm in length), only the bottom parts (about 8 mm, ca. 2–4 mg) could be broken by the tungsten beads. Small amounts (ca. 0.5–1 μL each) of the crude gDNA solutions containing about 2–3 ng gDNA μL-1 were directly transferred with a 96-pin replicator (or a multiple-channel pipetter) to 96-well PCR plates containing PCR solution (15–20 μL each well) for various types of PCR markers, such as Simple Sequence Repeat (SSR) and Insertion Deletion (InDel). Our tests showed that too large amounts (2 μL or more) or too high concentration (>10 mg broken tissue in 150 μL solution) of the gDNA
in PCR could suppress the amplification reaction, due to the carrying-in of higher levels of inhibitory materials from the crude gDNA solution. Therefore, it is important to control a suitable ratio of the amount of broken plant to the volume of tissue/preparation solution (ca. 2–5 mg, but no more than 10 mg in 150 μL solution). The PCR amplifications with the template gDNAs prepared by this protocol are reliable for amplification of PCR markers and relatively large (>1 kb) DNA. This 96-formated high through-put/low-cost method is especially suitable for genotyping large numbers of plant samples.
Keywords: Genomic DNA preparation; PCR; Genotyping
 
基于PCR的DNA检测技术已在如基因定位、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、转基因植株检测、以及种子纯度鉴定等基础和应用研究领域广泛利用。在大规模基于PCR的基因型检测操作中，模板DNA制备是一个影响工作效率的最重要因素之一。多年来,人们一直致力于对DNA抽提方法的探讨，并先后报道了一些相关的方法或简易制备法[1-5]。但需多步骤操作，且使用微量离心管，达不到高通量的要求，样品间DNA浓度差异大，重现性也不理想。本文介绍一种从种苗制备基因组DNA (gDNA) 模板、到转移模板DNA溶液至PCR反应液全程都采用96格式化高通量模板DNA制备的操作方法。该法不需纯化和乙醇沉淀DNA，因而操作简单快速，同时还适合于从干燥植物叶片制备模板DNA。所制备的模板DNA不仅可用于大规模分子标记(简单序列重复/微卫星SSR, 插入缺失InDel, 酶切扩增多态序列CAPS等)的基因型检测，大大提高基因型分析的效率，也可用于较大DNA片段(>1 kb)的扩增。
 
1  材料与方法
 
1.1  器具和试剂
 
    (1) 96方孔板(2.2 mL或1.6 mL容积)及其配套硅橡胶盖(建议使用国产品以降低成本)。
    (2) 96针复制器(方统科技生产或自制，见附录I)。
    (3) 钨合金珠(直径3 mm，Qiagen, Cat. 69997)或不锈钢珠（5直径mm）。
    (4) 普通涡旋器(其林贝尔QL-861)，或MTM-96研磨器(方统生物科技有限公司制造)。
    (5) 8通道或12通道移液器。
    (6) 96孔PCR板(国产品)。
    (7) 其他PCR扩增仪器和试剂及其电泳检测设备。
    (8) 10´制备缓冲母液：100 mmol L-1 Tris(pH9.5), 5 mmol L-1 EDTA, 1 mol L-1 KCl；1´制备缓冲溶液：使用前将母液稀释10倍。
    (9) 普通Taq酶(如上海申能博彩公司产品)及其他PCR试剂。
    (10) 其他常用试剂。
 
1.2  植物材料
 
1.2.1 水稻秧苗。将1.6-mL 96方孔板底部用6 mm电钻头打穿，或将旧96孔PCR板的底部剪去约4 mm。使用时将方孔板压入少量泥巴。每孔放入1粒萌动的水稻种子，在自然日光下(或人工气候箱)生长至3~4片叶。其他植物小苗也可用类似方法种植。
 
1.2.2 水稻大植株的鲜叶片或干燥叶片。
 
1.2.3 其他单子叶和双子叶植物的鲜叶片或干燥叶片。
 
1.3  操作方法
 
1.3.1  鲜叶片基因组模板DNA的制备
 
    (1) 用手摘取水稻秧苗叶一小段(对大植株的叶片，避开主叶脉撕取约3 mm宽的一小段)，放入2.2-mL或1.6-mL的96方孔板的孔中，叶片长度与方孔板深度大致相同，对其他单子叶植物叶片的操作与对水稻相同，双子叶植物叶片量为2~4 mg(不要太多)。
    2.2-mL或1.6-mL的96方孔板孔深分别为42 mm和27 mm，摘取的叶片放进去后与孔口差不多齐平。这样做的好处是震动打叶片过程中叶片顶端被盖压着不会往上跳，而下部约8 mm以下部位(约2~3 mg)才能被打碎。只摘约6~10 mm(2~4 mg)叶片段放入孔中也行，但在震动过程中会有叶片跳到孔壁上粘着而打不着的现象(震动时珠子也只在孔下部作用)。不要将叶片摘成多个小段放入一个孔中，这样不仅费时，更主要的是会过量打碎叶片而抑制PCR(被打碎的叶片不要超过10 mg 150 µL-1溶液，见下文和图2)。
    2.2-mL方孔板比1.6-mL方孔板的孔深，溶液不易弹到盖子上，可减少交叉污染的机会。也可用96孔PCR板，但容易卡住钨合金珠。
    (2) 每个孔投入1粒钨合金珠或不锈钢珠(钨合金珠比重大效果较好)。不推荐使用普通钢珠，因用过的钢珠会生锈，铁锈会抑制Taq酶活性。用多通道移液器加入150 µL 1´制备缓冲液，也可以用去离子水或0.5 ´ TE，但对DNA保存的稳定性不如用此缓冲液。盖好硅橡胶盖(可铺上1张保鲜膜再盖硅胶盖，打完开盖后丢弃保鲜膜)。
    (3) 用涡旋器振动3~5 min(如果是放入约6~10 mm长度的叶片，叶片跳到孔壁上会被粘着，因此期间要在桌面拍打96孔板几次，使粘在孔壁上的叶片落回底部)；或在MTM-96研磨器(设强度为中上)振动3 min。从底部往上看，可见溶液变浅绿色。
    (4) 用吊篮转子离心机离心约10 s(如没有此种离心机可省略此步骤)。
    (5) 直接用作PCR模板(1.3.3)。
 
1.3.2  干叶片基因组模板DNA的制备
 
    (1) 用剪刀将干叶片剪成约2~3 mm小段，放约2~3 mg到96方孔板的孔中(初次实验用分析天平检验用量的适合度，日常操作以经验目测即可)。
    (2) 每个孔投入1粒钨合金珠，盖好硅橡胶盖。放入液氮箱冻几分钟。
    (3) 用涡旋器(或MTM-96多功能研磨器)振动约2~3 min。放入有液氮的盒子内冻约30 s，再振动约2 min。
    (4) 离心约30 s，以便使粘在壁和盖上的叶片粉末落回底部。
    (5) 打开盖子，用多通道移液器加入150 µL 1´制备缓冲溶液，盖好硅橡胶盖。
    (6) 用涡旋器(或MTM-96多功能研磨器)振动3~5 min。
    (7) 将96方孔板置约90℃水浴加热约5 min。离心约1 min。
 
1.3.3  PCR反应
 
    (1) 分子标记检测用每块96孔PCR板，配制PCR液1600 µL，含上海申能博彩公司产Taq酶45 U (每35 µL反应液为1 U), 100~150 µmol L-1 dNTPs，PCR引物各约0.25 µmol L-1。如果2个标记的产物长度不重叠，可以在同一个反应里做2个标记的扩增(见图3-C)。用多通道移液器往96孔PCR板每孔分入15 µL。扩增较大片段DNA(>1 kb)时，反应体积为20~25 µL，0.8~1 U Taq酶。
    (2) 用96针复制器沾取约0.5~1 µL上述的gDNA溶液转移到PCR反应液。用过的96针复制器要马上泡在水中及时清洗。如果没有96针复制器，可用多通道移液器加约1 µL模板DNA，不要加入超过1.5 µL gDNA溶液，以免降低PCR的效率。
    (3) 如果需要保存模板DNA溶液一段时间，用强磁铁吸出合金珠,将样品放在20℃保存备用。
    (4) 根据引物的具体情况和扩增片段的长度设定合适的PCR条件(设预变性95℃ 1 min)。一般分子标记引物(18~22 nt)的扩增用32~35循环。按常规的聚丙酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
    (5) 将用过的96方孔板洗干净，可多次重复使用。
我们在检测共显性基因型(即长度多态)标记的gDNA样品中混入少于1/50量的另一种基因型DNA样品为模板进行测试，表明不会影响PCR产物的目的基因型的正确检测（结果未显示）。而用过的96孔板的残留gDNA量在新配制的gDNA中的比例远远低于1/100，因此不用担心重复使用96方孔板和96针复制器残留痕量基因组DNA的污染对后续试验的影响。但对于检测阳性/阴性样品的标记(即PCR产物的有/无，如转基因的有/无)，在阴性的样品DNA中污染痕量的阳性样品就可能产生PCR假阳性，因此对这类标记不要重复使用制备过gDNA的96孔板。
 
2  结果与分析  
 
2.1  对制备gDNA浓度的测定
 
    本方法制备的植物gDNA溶液未经纯化，含有RNA、蛋白质和叶绿素等杂质，因此不能用分光光度计测定其浓度。将制备的gDNA在琼脂糖凝胶上电泳也由于DNA浓度低且呈涂抹状而难以估计其浓度(结果未显示)。为了较准确测定该浓度，将纯化定量的籼稻品种93-11的gDNA梯度系列(0.5~8 ng，作为内参)和1 µL本方法制备的粳稻(02428)gDNA混合，用1个InDel标记引物进行PCR扩增和PAGE检测。结果表明，4个测试样品(每个样品2~3 mg叶片，加入150 µL溶液)制备的gDNA浓度为2~3 ng µL-1(图1)。
图1  用InDel标记PCR估算所制备的水稻基因组DNA浓度
Fig. 1  Estimation of concentrations of the prepared rice genomic DNA samples by PCR with an InDel marker
将纯化定量的水稻品种(93-11)基因组DNA标准样品(0.5~8 ng)与1.0 µL本方法制备的水稻品种(02428)基因组DNA混合作为模板，用InDel 标记引物(表1)进行PCR扩增和PAGE检测。箭头指某反应(或2个反应之间)其02428与93-11条带的信号值大致相等(即DNA等量点)，表明02428基因组DNA量与相应的标准DNA相当。
Different amounts (0.5–8 ng) of standard genomic DNA from a rice variety (93-11) were mixed with 1 µL genomic DNA from another variety (02428), and used as the template for PCR with primers (Table 1) of an InDel marker. Arrows show the band intensities in the reactions (or between two reactions) of 02428 and 93-11 were similar, indicating that the amounts of 02428 gDNA were about the same as those of indicated standards.
 
表1  本研究所用的PCR引物
Table 1  Primers used in this study
引物编号
Primer No.
序列
Sequence (5’–3’)
对应的图
Corresponding Figure
1
TGTGTGCTTTCGCTGAAGAGA;
TGTGCTCAGCCATAGGGTGTGTT
图1
Figure 1
2
CGACATGTTGGCTATAAGG;
ACCGGCCAATATTCCTTTG
图2-A~C, E,F
Figure 2 A–C, E,F
3
ATGGTACTACACACGTTTGT;
GAAACTCATACCTTACTTCA
图2-D (左)
Figure 2 D (left)
4
TGCTCATCCTGCAGCTTCTTC;
CGATCGGTTATTAACTCTTCCAT
图2-D (右)
Figure 2 D (right)
5
GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC;
CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG
图2-G (上)
Figure 2 G (up)
6
GAGGTAGAAACCCACCCTAAA;
CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG
图2-G (下)
Figure 2 G (down)
7
CCCTTACGTGCAGTACATTG;
ATGCAGGCTACTTACTAGCG
图3-A
Figure 3 A
8
TCCTCCCTCTGTACCATTTG;
ACGCCAAGAAAGTCATATGG
图3-B
Figure 3 B
9
TCAACCAGTGAAGGGTCGACG;
CTCAGTTGTCACGATGTGAACG
图3-C (M1)
Figure 3 C (M1)
10
GCGGTTGTGAAAGGCTAATCC;
AAGCAGCAGGAAATGGGAGTG
图3-C (M2)
Figure 3 C (M2)
 
2.2  加入不同量模板DNA的PCR效果
 
    在一定量溶液中放入过多此方法制备的gDNA会带入过量的杂质，因而会抑制PCR反应。我们的结果显示，用2~3 mg叶片(150 µL)制备的模板(加入1 µL)的PCR效果(扩增830 bp)比用10~12 mg(150 µL)制备的模板的扩增效果要好(图2-A, B)。进一步检测加入不同容量gDNA(用3 mg叶片150 µL-1溶液制备)的PCR效果表明，20 µL PCR反应中加入上述方法制备的DNA 0.5~1.0 µL的扩增效果比加入2 µL的效果好；加入1 µL DNA和1 µL TE(含有1 mmol L-1 EDTA)的扩增效果更差。说明即使控制好合适的叶片量和溶液的比例，加入过量DNA溶液也因带入过多的杂质和EDTA(制备液含有EDTA)而抑制PCR反应。因此，本方法的关键是要控制适合的叶片量和溶液的比例，同时加入的DNA溶液量不要超过PCR反应液的1/10。事实上，使用少至0.1~0.2 µL的模板DNA(约0.2~0.4 ng)就足以产生良好的PCR扩增效果(图2-D)，说明模板DNA量(指低量)不是一个限制性因素。虽然将较高浓度的DNA(放入较多的叶片量)稀释使用也可避免抑制PCR，但从操作的简单化和效率化考虑，最好直接确定一个合适的叶片量与溶液比例范围，以减少操作步骤。在实际操作中只摘取1段长度与96孔板深度相当的幼叶放入各孔中，由于只有下端约8 mm以下部分才能被合金珠打碎，因此不会产生叶片量与溶液比例过高的问题。用本方法也可从干燥叶片制备模板DNA做PCR(同样要注意控制投入的叶片量不能过多，图3-E, F)，适合于对野外采集和干燥保存的植物样本的检测。用本方法从其他植物制备的基因组DNA(如拟南芥，图2-G)做PCR也产生良好的效果。
图2  用本方法制备的植物gDNA的PCR扩增效果
Fig. 2  PCR effects using the prepared gDNA templates
A, B: 分别从约2~3 mg水稻苗鲜叶片150 µL-1缓冲液和约10 mg水稻苗鲜叶片150 µL-1缓冲液制备的DNA，取1.0 µL gDNA为模板进行PCR扩增。 C: 从3 mg水稻苗叶片 150 µL-1缓冲液制备的gDNA取不同量为模板进行PCR(20 µL反应)。D: 用递减的不同量gDNA (2~3 mg水稻苗鲜叶片150 µL-1缓冲液) 进行PCR标记(InDel)的扩增。E, F: 分别从2~3 mg水稻干燥叶片150 µL-1缓冲液和约10 mg水稻干燥叶片150 µL-1缓冲液制备的DNA，取1.0 µL为模板进行PCR扩增。 G: 从约2~3 mg拟南芥鲜叶片150 µL-1缓冲液制备gDNA，取1.0 µL为模板进行PCR扩增。A~C, E~G反应为20 µL PCR反应，含有0.8 U Taq酶。PCR条件为95℃ 2 min, 33 循环的94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min。D的PCR条件与图3相同。
A, B: PCR using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of seedling leaf tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. C: Using different volumes of rice gDNA prepared from 3 mg seedling leaf tissue in 150 µL preparation buffer as PCR template. D: Use of decreased amounts of gDNA (from 2–3 mg seedling leaf in 150 µL preparation buffer) for performing PCR with InDel markers. E, F: PCR using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of dried leaf tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. G: PCR using 1.0 µL Arabidopsis thaliana gDNA prepared from 2–3 mg fresh leaf tissue in 150 µL preparation buffer. A–C, E–G were conducted in 20 µL PCRs containing 0.8 U Taq, with thermal conditions of 95℃ 2 min, 33 cycles of 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min. PCR setting and thermal conditions in D were the same as those in Fig. 3.
 
2.3  高通量的分子标记检测
 
    本方法制备的DNA浓度虽然低，用96针复制器加入0.5~1 µL模板进行33~35个PCR循环就可获得足够浓度的产物，并不需要加入特别多的Taq酶(甚至使用量为每45~50 µL PCR反应液1 U也能扩增分子标记)。该方法已对数万份水稻样品进行了分子标记(SSR、InDel等)检测，成功率一般可达95%以上。事实上，用微量提取法(经乙醇沉淀)粗提的基因组DNA往往由于样品间浓度差别大，定量不准确，容易加入过多的模板DNA而抑制PCR (粗提的基因组DNA也含有相当多的杂质)，因而用微量提取法粗提基因组DNA进行PCR扩增的成功率和整齐度反而不如本文介绍的方法好。图3显示若干PCR标记的实验例，扩增效果和整齐性非常好。另外，还可以在同一个反应里做2个标记的PCR扩增(图3-C)。
Fig. 3 PCR marker-based genotyping using the prepared rice seedling gDNAs as templates
A: 用SSR标记对水稻种质材料进行基因型检测。B, C: 用Indel标记对水稻分离群体进行基因型检测。2个InDel标记(M1, M2)在同一PCR反应进行基因型检测(C)。所有PCR反应是用96针复制器加入gDNA约0.5 µL，PCR条件为95℃ 2 min, 35循环的94℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 30 s. A: Genotyping of rice germplasms with a SSR marker. B, C: Genotyping of rice segregation populations with InDel markers. Two markers (M1, M2) were analyzed in the same PCRs (C).
 
3  讨论
 
    已报道的各种植物DNA简易制备方法大都是用微量离心管对每个样品进行 编号、组织破碎、抽提、沉淀、干燥、溶解、定量多步骤操作，效率很低。本文的方法全过程采用96格式化操作，基因组DNA制备过程中不需要分别对每个样品进行标签和操作，非常简便快捷，通量高，且成本极低(国产96方孔板价格低，且可重复使用)。叶片采集放入96方孔板后，从加入制备溶液、震动破碎、到转移模板DNA至PCR液(不算PCR液配制)只需6~7 min。用96针复制器不会转移过量的模板DNA溶液(多通道移液器取约1 µL溶液时误差较大)，不仅快速，还节省移液头和移液头装盒的人工成本。我们用此方法已制备了10多万份水稻样品的gDNA用于PCR基因型分析，显示出此方法的高效率。本文还介绍了自制96针复制器的方法供参考（附录I）。
 
4  结论
 
    本文介绍的高通量操作方法简单，效果好，省时省力，能大大提高工作效率，在基础研究和生物技术育种等领域将发挥重要作用。
 
References
[1]  Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep, 1983, 1: 19-21
[2]  Wang X-F(汪秀峰), Yang J-B(杨剑波), Xiang T-H(向太和), Li L(李莉), Ni D-H(倪大虎). A new method for PCR reaction from alkali-treated rice leaf tissues. Chin J Rice Sci (中国水稻科学), 2002, 16(1): 67-70 (in Chinese with English abstract)  
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附录I：96针复制器制作方法
    (1) 将约6 m长1.2 mm或1.5 mm直径的#304不锈钢丝(低于#304的会生锈)拉直（一端固定在柱子上，把另一端绑在木棒上，用力拉几下）。用钢钳剪成每段45 mm。用钳夹着钢丝一端，用钢锉(较细纹的)锉平一端的端口。
    (2) 将3~4 mm厚有机玻璃板裁成80 mm  120 mm。用旧96孔PCR板沾上稀释墨水在机玻璃板印上96个点。用铁钉在每个点中心敲打出1个浅孔(目的是防止钻孔时移位)。
    (3) 对应1.2 mm或1.5 mm不锈钢丝，用稍大些直径(如1.5 mm或1.8 mm)的电钻头在96个点垂直打孔。
    (4) 用强力胶(如A、B两种胶等量混合后几分钟内硬化的强力胶)先将3根针粘结在3个角的孔中(即A1, A12, H1位置)(没有锉平的一端粘在板上，锉平端做脚底)，等强力胶固化后，将第4根粘在第4个角（即H12位置），在胶固化之前将这个“4脚桌子”脚向下放在平板上，上下微移第4根针，使4根针都接触到平板(即不翘脚)。
    (5) 将其余的针(每次同时操作2~3根)粘在剩余的小孔中(锉平端作为脚)，在胶固化之前将针调整到与2端的针同一个平面(针朝下放在平板上，使每条针都接触到板面)。
    (6) 将1块旧96孔PCR板的管底在砂布(纸)上磨至快要穿的状态，然后套在粘好的96针上，用力压下96孔PCR板使针把管底刺穿。使96孔PCR板管底留在针端位置(以便在下一步骤打磨时固定针端)。
    (7) 将复制器半成品的针端平铺在平整桌面上的砂布(砂纸)上来回移动打磨，直至将所有针端磨到同一个平面。  
    (8) 在固定96针的有机玻璃板上面再粘一块80 mm  120 mm机玻璃板(厚度不限)，上面再粘一个把手，就完成了制作。
    (9) 检测96针复制器每针取样量：往96孔PCR板每孔加入30~40 µL制备缓冲液（或水），用微量分析天平称重回零；用96针复制器沾取96孔PCR板的水1次(或将针粘取的水分擦干后再重复沾取2~3次)，再称96孔PCR板已减少的液量，算出平均每针每次的取液量。
附图1 用不锈钢丝（#304）自制的96针复制器 Supplementary Fig. 1 A home-made 96-pin replicator made from stainless steel wire
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