兔抗小麦钙调素抗血清制备及纯化

黄　 晨, 　 侯春燕, 　 王冬梅 (河北农业大学 生命科学学院 , 河北 保定 071001)

摘要: 为制备兔抗小麦钙调素抗血清并对其进行纯化 ,首先从小麦叶片中提取钙调素蛋白 ,对其初步纯化后免

疫家兔 , 制备得到兔抗小麦钙调素抗血清 ,再以大肠杆菌中诱导表达的拟南芥钙调素蛋白作为抗原 ,利用 PVDF

膜结合法纯化得到了兔抗小麦钙调素抗血清 ,并通过 Western Blot ting对所纯化的多克隆抗体进行了鉴定。

关 　 键 　 词: 钙调素; 多克隆抗体; 纯化; Western Blot ting

中图分类号: Q 942. 6 文献标识码: A

Preparation and purif ication of rabbit

anti2wheat calmodul in antiserum

HUANG Chen , HOU Chun2Yan , WANG Dong2mei

(College of Life Science ,Agricultural University of Hebei ,Baoding 071001 , China)

Abstract : To prepare and purify rabbit anti2wheat calmodulin antiserums , calmodulin protein was

ext racted f rom wheat leaves for immuned rabbit s af ter preliminary purification. Then A rabidopsis

thal iana calmodulin protein was used by E. col i induced expression as antigen to purify rabbit anti2

wheat calmodulin antiserum by PVDF membrane binding. The purified polyclonal antibody was i2

dentified by the Western Blot ting.

Key words : calmodulin ; polyclonal antibody ; purification ; Western Blot ting

钙调素(Calmodulin ,CaM)作为 Ca2+的多功能受体蛋白在钙信号系统中发挥着重要作用,因此 Ca2+/CaM是目前植物细胞信号系统中研究得最为深入和广泛的途径之一。毛爱军等的工作初步表明,Ca2+/CaM参与了小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的过敏性反应(Hypersensitive reaction ,HR)[1 ],为了进一步深入探讨CaM在小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的 HR中的作用,制备小麦 CaM 特异性抗体是必须的,它是 CaM 定位、定量及生理功能研究中最有效、 最特异的试剂。由于CaM分子量小(17 kD) ,在进化上高度保守,使其免疫源性较弱,难于制备高效价抗体。本研究以初步纯化的小麦 CaM 蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,并对抗血清进行了纯化,以期为深入探讨不同亚型 CaM的亚细胞定位准备实验基础。

1 　 材料与方法

1. 1 　 材料

1. 1. 1 　 供试小麦品种　 以小麦( Triticum aestivum品种洛夫林 10 为试材。小麦幼苗用直径15cm的花盆土培 ,生长于人工气候培养室 ,昼/夜温度为25/ 20 ℃,镝灯照射 ,光照强度为 400 W/ m2,光照周期14 h/d。小麦幼苗 7 日龄时取叶片提取 CaM。

1. 1. 2 　 供试动物　 家兔 2 只 ,购自保定兔场。

1. 1. 3 　 供试菌种　 含pET28 - CaM(拟南芥 CaM)重组表达质粒的BL21 (DE3 )工程菌 ,由河北师范大学细胞生物学实验室馈赠。

1. 2 　 试验方法

1. 2. 1 　 小麦 CaM 的制备 　参照文献[ 2 ]的方法提取小麦 CaM ,并通过加热、 盐析、 等电点沉淀和透析对其进行初步纯化后作为免疫家兔的抗原。另外利用三氯乙酸 - 丙酮沉淀法制备小麦全蛋白 ,作为小麦 CaM 提取方法的对照。

1. 2. 2 　 兔抗小麦 CaM 抗血清的制备　 采用背部皮下多点注射法。免疫前采血作为对照血清 ,初次免疫将初步纯化的小麦 CaM 5 mL 与弗氏佐剂 5 mL混合成乳化液 ,分 5 点分别注射到 2 只家兔背部。初次免疫 10 d 后进行加强免疫 ,随后 20 d 免疫1 次 ,之后每周免疫 1 次。初次免疫选用完全弗氏佐剂(Sigma 产品) ,此后均用不完全弗氏佐剂与抗原混合。每周注射时先于耳缘静脉取血 2 mL 做酶联免疫分析( EL ISA) ,检测抗体效价 ,至抗体效价达到要求 ,颈动脉取全血 ,收集血清 ,分装后在 - 70 ℃冷冻保存。

1. 2. 3 　 抗血清中抗体效价的检测 　综合文献[ 3 -4 ]的方法 ,通过 EL ISA 法测定抗血清中抗体的效价。以大肠杆菌中诱导表达的拟南芥 CaM 蛋白作为抗原 ,分别用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释至30μg/ mL ,每孔加入 100μL ,4 ℃隔夜包被酶标板 ,再用含 015 mL/ L Tween - 20 的 PBS(即 PBST)冲洗酶标板 3 遍 ,每孔加入含 10 g/ L BSA (生工生物工程上海有限公司产品)的 PBST 100μL ,37 ℃ 封闭2 h,然后用 PBST冲洗 3 遍,加入用封闭液稀释(先稀释 1 000 倍后再倍比稀释)的对照血清(免疫前)和兔抗小麦 CaM 血清(免疫后) ,37 ℃反应 2 h ,用PBST冲洗 5 遍 ,加入相应辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG抗体( Goat anti - Rb IgG/ HRP ,BIOS产品; 1∶1 000 稀释,100μL/孔) ,37 ℃ 反应1 h ,最后用PBST冲洗 6 遍 ,加入含过氧化氢的底物 OPD 溶液 ,室温避光显色 30 min ,2 mol/ L H2SO4 终止反应(50μL/孔) 。用酶联免疫检测仪检测A490值。

1. 2. 4 　拟南芥 CaM 蛋白的诱导表达 　参照文献[5]的方法并稍做改进。将带有拟南芥 CaM 重组子的大肠杆菌接种到 LB 液体培养基上 ,在摇床中37 ℃ 培养过夜。取过夜培养基接种于 LB 培养基液体扩繁 ,在摇床中 37 ℃培养直到细菌密度达到OD600 = 015 ,向培养基中加入 IPTG诱导表达 CaM,37 ℃ 继续培养 4 h。然后以 5 000 ×g 离心 10 min ,

4 ℃收集菌体 ,再将沉淀重悬于裂解缓冲液 ( 2 %SDS ,5 % β- ME , 50 mmol/ L Tris - HCl ,pH 8. 0)中 ,煮沸5 min使细胞完全裂解。以20 000 ×g离心30 min 以纯化裂解液 ,收集上清液 ,最后经 SDS -PAGE电泳检测。

1. 2. 5 　PVDF 膜结合法纯化 CaM 抗血清 　根据文献[6 ]的方法 ,运用 PVDF 膜(MILL IPORE)纯化抗体。首先将 PVDF 膜先在甲醇中浸泡 5 min ,快摇慢加蒸馏水 ,使甲醇稀释至 20 %。再在稀释的裂解液中渗泡 15 min ,然后转入在拟南芥中诱导表达的CaM 蛋白 ,使其与膜共孵育 1 h。然后用含 1 %Tween - 20 的 TBST 洗膜 4 次 ,每次 10 min ,再在TBS中洗膜1 次 ,于温室下用含有3 %BSA 的 TBST封闭3 h 后 ,将膜放到含有3 %BSA 的 TBST稀释的抗血清中于室温下浸泡 3 h。之后用 TBST 洗膜4 次 ,每次 10 min ,再在 TBS 中洗膜1 次。 然后于室温下将膜浸在 10 mL 011 mol/ L 甘氨酸缓冲液中(pH 215)作用10 min ,以使抗CaM 特异抗体从膜上洗脱下来 ,并以 1 mL 1 mol/ L Tris - HCl (pH 810)与之中和。以上操作均在脱色摇床上进行。将得到的纯化的抗血清分装 ,储存在 - 70 ℃ 备用。

1. 2. 6 　Western Blot ting 分析 　将小麦叶片提取的可溶性全蛋白和初步纯化的小麦 CaM 经 SDS -PAGE后,转移至 PVDF 膜上。TBS 洗膜 1 次,用含有5 %BSA的 TBS在室温封闭 1 h , TBST洗膜1次。然后放入用含有 1 %BSA 的 TBS稀释的 PVDF膜结合法纯化获得的抗血清,4℃过夜。用 TBST 在室温下洗膜3次。再加入1∶ 10的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG抗体于37℃ 温育1 h ,TBST 洗膜3 次,将膜用滤纸条吸干多余的 TBST ,正面朝上放在封口膜上,将检测液(MILLIPORE产品)均匀加在膜上,室温孵育3 min。暗室 X胶片压片曝光3 min后显影定影检测。并且以1∶ 50 000 含有 1 %BSA的 TBS稀释的抗血清作为一抗,进行同步对照试验。

2 　 结果与分析

2. 1 　 小麦叶片 CaM制品检测

从小麦叶片中获得的初步纯化的 CaM(图 1)与大肠杆菌表达的马铃薯 CaM 和大肠杆菌表达的拟南芥 CaM 粗提液相比 ,与本试验所用的小麦叶片全蛋白相比 ,蛋白条带减少了很多 ,说明经加热、 盐析、等电点沉淀、 透析等方法已经去除了大部分杂蛋白质 ,并且保留了 CaM 蛋白 ,达到了初步纯化的目的。M:低分子量蛋白 marker ; 1 :大肠杆菌表达的马铃薯 CaM; 2 :初步纯化的小麦 CaM; 3 :小麦叶片全蛋白; 4 :大肠力表达的拟南芥 CaM粗提液

图 1 　SDS - PAGE电泳考马斯亮蓝染色

Fig. 1 　SDS - PAGE staining with coomassie brill iant blue

2. 2 　 抗体产生及效价测定

用初步纯化的小麦 CaM 提取液作为抗原免疫家兔获得抗 CaM 抗血清 , EL ISA 法测定抗血清效价。免疫前的对照血清对抗原基本没有反应 ,而加强免疫后的抗血清效价不断提高 ,末次免疫后的抗血清对抗原的反应滴度都在 1∶ 256 000 以上(见图2) 。

图 2 　ELIS检测抗血清的效价

Fig. 2 　ELISA detection of antiserum titer

2. 3 　 多克隆抗体的特异性检测

对经 PVDF 膜结合法纯化的抗小麦 CaM 多克隆抗体进行 Western Blot ting分析 ,以纯化前的抗血清作为对照。结果表明:纯化后的 CaM 多克隆抗体与本试验初步纯化的小麦 CaM 抗原能够特异结合(图 3)重要的是在小麦全蛋白中也能检测出特异条带 ,条带位置与大肠杆菌表达的马铃薯 CaM 检测的条带一致 ,并且与纯化前的抗血清检测的初步纯化的小麦 CaM 相比条带更清晰特异性更强。说明所制备的抗体是针对小麦 CaM 的特异性抗体。M:低分子量蛋白 marker 转 PVDF 膜后的考马斯亮蓝染色结果;A :以纯化前的抗血清为一抗孵育的结果;A - 1 初步纯化的小麦 CaM;A - 2 大肠杆菌表达的马铃薯 CaM;B :以 PVDF 膜结合法纯化后的抗血清为一抗孵育的结果;B - 1 小麦叶片全蛋白;B - 2 初步纯化的小麦 CaM

图 3 　Western Blotting检测结果

Fig. 3 　Western Blotting test results

3 　 结论与讨论

CaM是一种能与 Ca2+结合的蛋白质 ,Ca2+被称为细胞内的第二信使 ,其浓度变化可调节细胞的功能 ,无论是在动物还是在植物中 ,CaM 基因都是以家族的形式存在的。SenGupta 等人[7]的研究表明 ,在多种动物中都存在 CaM 的基因家族。Takezawa等[8]、 Lee等[9]、 Yang等[10]的研究证明了在植物中 CaM 基因也是以家族的形式存在 ,而且这些基因编码不同亚型的 CaM。植物在进化过程中保留了不同亚型的 CaM ,这意味着在植物体的生长发育过程中不同亚型的 CaM 可能起着不同的作用。Lee等人[9]利用 Northern Blot ting 的方法对大豆CaM 的 mRNA 分布进行了研究 ,结果表明发育过程中不同器官中的 CaM 亚型基因的表达有差异。Heo 等人[11]研究发现大豆 CaM 亚型 ScaM - 4 和ScaM - 5 在病原物激发子刺激后的核酸水平和蛋白水平表达上都有明显升高。并且 Lee 等人[12]发现ScaM - 4、 ScaM - 5 与已发现的大部分植物 CaM 亚型对不同的靶酶的催化激活作用有显著的差异。因此 ,植物体中不同亚型的 CaM 尤其是氨基酸序列差异较大的亚型在生物学功能上可能有所不同。因为CaM 分子量小 ,保守性强 ,免疫源性较弱 ,所以 CaM抗体的制备比较困难。本试验中,以初步提纯的小麦 CaM 为抗原免疫兔子 ,获得了抗血清。然后再以大肠杆菌表达的拟南芥CaM 为抗原 ,通过 PVDF膜结合法来纯化制备的抗血清。最后获得了能够与小麦 CaM 呈特异结合的多克隆抗体 ,且收率较高。试验结果显示出以 PVDF 膜结合法纯化抗血清的方法有诸多优点:首先方法流程简单 ,所涉及的仪器设备少;再者就是此方法对一般实验人员来说容易掌握。在许多蛋白质的纯化过程中 ,一般所需的仪器设备都比较复杂且价格昂贵。本试验中通过 PVDF膜结合法来纯化制备的抗血清 ,整个流程都比较简便 ,对蛋白粗提液只进行了初步纯化即可作为抗原免疫动物 ,在利用 PVDF 膜结合法对抗血清进行纯化时 ,仅需脱色摇床这一种普通的实验仪器。最终从混合蛋白样品制备的抗血清中分离得到了特异性较好的多克隆抗体 ,说明整个纯化过程很好地保持了抗体的免疫功能。所得抗体可用于小麦的 CaM定量、 定位及生理功能的研究。为了对 CaM 功能做进一步的研究 ,制备 CaM特异性抗体是必须的 ,它是 CaM 定位、 定量及生理功能研究中最有效、 最特异的试剂。已有报道 ,小麦具有 3 种亚型的 CaM 蛋白 ( TaCaM - Ⅰ, Ⅱ,Ⅲ)[10 ],但是这 3 种亚型在信号转导中的作用是否存在差异还不明确。构建小麦 CaM 不同亚型的重组子 ,并分别以工程菌表达不同亚型 CaM 蛋白为抗原 ,分离纯化小麦 CaM 不同亚型的特异性多克隆抗体是进一步深入研究小麦 CaM 在小麦抗叶锈菌侵染诱发的防卫反应过程中具体功能所必须的。因此 ,本试验所建立的以 PVDF 膜结合法来纯化制备的抗血清从而获得特异性的多克隆抗体的方法 ,为深入探讨不同亚型 CaM 的亚细胞定位及其生物学功能奠定了重要试验基础。

参考文献:

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