使用Bead Ruptor Elite提高皮肤样品的mRNA产量

Drexel Neumann1，James Atwood1，Tahseen Nasti2，Yuko Tsuruta2，Barry Cochran2和Laura Timares2 1Omni International，Kennesaw，Ga。 2Dept。的阿拉巴马大学皮肤科和皮肤病研究中心在伯明翰，伯明翰，阿拉巴马州。

转录组研究越来越受到监测基因表达全球变化的影响1。特别是，疾病与健康状态之间的转录组变化可以为理解疾病状态的免疫应答机制提供有价值的见解。然而，高质量的mRNA从坚韧的组织如皮肤中分离可能是研究中的重大挑战。在这里，我们比较了从两种鼠皮肤类型的mRNA提取的两种方法，其中特别关注mRNA产量和完整性。我们的研究表明使用珠磨机技术作为最佳选择的有效性的转录组学研究中的样品制备。

材料和方法

从耳朵和腹部获得8只小鼠皮肤样品。将皮肤样品切成1cm 2样品，与脂肪分离并保持在冰上直到匀浆。将皮肤样品切成片，然后置于1mL Trizol中，并在Dounce均化器中手动匀浆并通过在2ml珠中的Bead Ruptor Elite（Omni International，Cat＃19-040E; 19-010-310）上珠粒打浆预先填充有2.8毫米RNA酶/无DNA酶陶瓷珠（Cat＃19-628）的管。珠子打浆以7.45m / s进行45秒。

在7.45m / s下进行两个循环45秒，循环之间45秒停留。

均质后，将样品离心以沉淀不溶物质。将30μL上清液进行标准mRNA提取方案，并取出OD 260/280读数以确定mRNA浓度和纯度（图1）。基于测定的浓度，将约1μg与加载缓冲液混合，并在70℃×1分钟热处理后在1.2％非变性凝胶上运行，然后在冰上快速冷却。

使用Agilent 2100 BioAnalyzer（图2）另外分析每个样品的mRNA纯度和完整性。

结果

来自皮肤样品的mRNA的分离存在许多挑战，包括皮肤的韧性，RNA酶丰度和降解的可能性

从机械中断过程。机械均质化的机械破裂（玻璃砂浆杵）历来是机械均质化的既定方案，然而对于坚韧的样品类型和大批量采样，手动多孔均质化是一个重大的瓶颈。珠磨是一种相对较新的技术，是克服这些问题的有希望的方法。我们的研究结果表明珠磨削消除了这个障碍，并产生高的mRNA产量与卓越的完整性

280nm吸光度值表明，当进行珠磨时进行比较，mRNA产量范围为26至99μg

通过杜氏均匀化达到9〜30μg;代表mRNA产量平均增加4倍（图1）。 260/280nm比率表明两种均质化技术之间的mRNA纯度相当，因此珠磨不影响样品纯度。

为了评估mRNA产生与起始样品量是否相关，使用2×1cm 2耳朵和腹侧皮肤样品重复匀浆。对于较大的样品，珠打浆是

图1 A和B总mRNA产量和相对纯度：使用260nm和280nm处的吸光度值来确定提取后的总mRNA产量和纯度。当进行珠磨时，与杜氏均匀化相比，mRNA产量平均高4倍。两种方法（B）之间的核酸相对纯度相当。

结果（续）

使用安捷伦生物分析仪2100生产的电泳图显示，多孔匀浆产生具有高分子量污染物DNA和低分子量降解物质的样品，而珠磨均质化产生高纯度和RNA完整性的mRNA。

全能珠Ruptor精英

杜恩斯

图2 A和B安捷伦生物分析仪电泳图：电泳图显示提取的RNA完整性和纯度：使用每个样品的电泳图读数（右图）制作合成电泳凝胶（左图，包括RNA 600梯）。用Bead Ruptor Elite匀浆的样品显示出良好定义的28S和18S峰值，噪音最小（右上图）。相反，Dounce均质器生产的样品表明存在高分子量DNA污染物和低分子量降解RNA（右下）。

致谢