近日中科院上海神经科学研究所在《Cell》上发表了一篇关于成功克隆长耳猕猴的文章。文章一经发表，除了我天朝，西方各大新闻媒体也纷纷进行了报道，虽然画风略有不同，都不约而同地把伦理道德的大旗拎出来遛了一圈儿。

 

        这毕竟是科学家们第一次成功克隆的非人类灵长类动物啊，距第一只克隆羊诞生，时间已经过去了20多年了！在这之前，什么老鼠啊，牛啊，猫啊，狗啊，大概20多种哺乳动物都已经被成功克隆，但是作为更理想的人类疾病的动物模型，非人类灵长类的SCNT克隆却是屡战屡败，最成功的应该是俄勒冈健康与科学大学的Matalipov小组利用SCNT技术成功克隆提取猕猴和人类的胚胎干细胞，然，他们培育出的胚胎却长不成活的小猴子╮(╯_╰)╭。So，刘真，蒲慕明和孙强小组的这篇文章也不得不让西方科学家们酸溜溜的说一句“a good piece of science”。

  
        首先来看看成功突破克隆猴的关键在哪里。大家都知道SCNT（somatic cell nuclear transfer）技术就是把nuclear donorcell （提供细胞核）注入到去核的卵细胞中，细胞融合之后，前者的细胞核在激活的卵细胞内reprogram，从而发育成胚胎。理论听上去很简单，但实际操作却困难重重，就像前面提到的Matalipov小组，他们前后大概用了1万5千多个猴卵细胞，却没能成功培育出一只活的小猴子，最好的一次，胚胎发育到80几天的时候，母猴流产了。刘真博士及其同事们发表的这篇文章中提到，有效的reprogramming是决定胚胎成功发育的关键。那么笔者觉得有两个方面至关重要。第一，迅速精准的卵细胞去核以及donor cell的注入保证卵细胞状态完好，第二，通过对表观遗传修饰的调节来有效的重新启动donor cell的遗传信息。嗯，无论做什么实验，理论要可行，操作要犀利，就是这个意思。

        当然论文中并没有介绍，只是据笔者八卦，刘博士的卵细胞去核操作只需要10秒，而体细胞注入只需要15秒，要知道即使是在偏光显微镜下，猴子卵细胞的细胞核也是挺难分辨的，所以说刘博士这波微操作真是666，谁说只有打游戏需要手速了！说起来做生物实验，这个手感也是迷一样的存在，同样的protocol，有的人做得出来有的人就总是失败。刚刚入坑的时候，即使是最简单的质粒抽提，一样的plasmid一样的试剂盒，提出的DNA浓度和师姐的相比简直是惨不忍睹。构建一个质粒花了好几个礼拜，各种限制酶连接酶，不是切不开就是连不上，从那时起，就对手感这个东西产生了深深的阴影。扯回来，大部分实验操作还是，“无他，唯手熟耳”。据说刘博士花了3年的时间优化和练习，才能在最短的时间以最小的损耗完成去核。卵细胞的完好是保证reprogramming的基础。

        在此之上呢，克隆成功的主要核心还在于利用组蛋白去甲基化修饰以及抑制组蛋白去乙酰化酶能够显著提高胚胎质量和代孕成功率。刘真博士等根据前人对表观遗传修饰在SCNT中的研究，在卵细胞激活过程中加入了组蛋白去乙酰化酶的抑制剂TSA(trichostatin A)，并对融合后产生的胚胎注入了组蛋白去甲基化酶 Kdm4d mRNA。我们知道组蛋白修饰对于染色体结构以及基因表达都起着至关重要的作用，比如乙酰化，一般来说促使组蛋白八聚体与DNA解体，核小体松弛，转录因子可以和DNA特异性结合从而激活转录。研究中显示，去核卵细胞和donor cell 的融合后，在激活卵细胞的过程中及之后，加入TSA （去乙酰化酶抑制剂，很绕对不对，就是负负得正），能够大幅度提高囊胚（blastocyst）时期的内细胞群（Inner Cell Mass，ICM），从而保证胚胎的质量。另一方面组蛋白甲基化对基因表达的调控就复杂一点，有的残基甲基化与基因激活有关，有的残基甲基化则与基因沉默相关，具体到这篇论文，刘真与孙强小组用的是组蛋白H3K9三甲基化赖氨酸残基的去甲基化酶Kdm4d，将其mRNA注入到SCNT生成的胚胎中，结果显示不论是囊胚还是ICM的生成率都大幅提高。

（上图片来源于《Cell》)

        培育的成功率虽然提高了，成功克隆出小猴子依然很难。首先，用成年母猴的cumulus cell (卵丘细胞)作为核供体，虽然能培育出胚胎并成功受孕，但是出生的小猴伴有呼吸衰竭，成活时间最长也只有30个小时。而运用胚胎小猴的fibroblast作为核供体的，生成的79个SCNT胚胎植入21只代孕母猴，只有6只成功怀孕，而最终两只幸运的小猴子成功出世，一只叫中中，一只叫华华，遗传分析确认了两只小猴的核DNA与dornor cell完全相同，而线粒体DNA则来自各自的卵细胞供体母猴。

（上图片来源于《Cell》)

        克隆猴这个技术在我天朝是有优良传统的。话说大约唐代的时候，孙大圣保唐僧西天取经，他有个动不动就拔毫毛变小猴子的坏毛病，不知道怎么就被六耳猕猴搞到了一根，根据体细胞克隆技术华丽丽的复制了一个完全一样的身体，谁也分辨不出来。好在如来佛祖那里有一套基因分析系统显了神通，然后发现哈哈，六耳猕猴的线粒体DNA不对啊，于是真假大圣的故事才有了美好的结局！

        扯淡完毕，来谈谈克隆猴研究的意义吧。纵观西媒的报道，除了nature 等学术期刊，大多数新闻媒体对克隆猴的医学意义都是匆匆几笔，然后就扯着动物实验，克隆人等等伦理道德的大旗作担忧状。好吧，我们不想讨论这背后隐藏的政治因素。无论如何，克隆动物一直是疾病研究最好的模型，而克隆猴的第一个用途就可以应用在帕金森症的研究上。对于人类大脑及神经的紊乱退化等种种问题，灵长类动物的大脑是明显比其他动物是更合适的模型，而显然克隆猴可以减少实验研究中由不同的遗传背景带来的个体差异，减少实验动物的数目。nature中提到，目前用于研究猴类胚胎发育的基因编辑技术有一个无法解决的问题，就是可能不是所有的细胞都可以被编辑。而利用SCNT克隆技术，研究人员可以先对供体细胞进行编辑，然后再注入去核卵细胞，培育出被完全编辑的胚胎，从而建立帕金森等脑部紊乱的动物模型。据报道，上海正在计划投资建立国际灵长类动物研究中心，为全球的研究人员提供克隆动物模型，而已经有药厂提出了对克隆猴的需求用于进行药品测试。
        借用纽约时报报道克隆猴的标题“Yes, They’ve Cloned Monkeys in China. That Doesn’t Mean You’re Next”

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