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共聚焦原理解析(八):无限远光学系统

2022-01-05     来源:徕卡显微镜     点击次数:397


 
从无限远光学到无限远接口
“无限远光学”这一概念是指在显微镜的物镜和镜筒透镜之间具有平行光线的光束路径。平面光学元件可以进入到这个“无限远空间”中,而不影响成像,这对于利用DIC或荧光等对比度方法至关重要。
现代显微技术需要在无限远光路中添加多种光学仪器,如光源或激光装置。满足这一需求的不同方法已经出现,本文对其进行了描述。

从安东·范·列文虎克到复式显微镜
自公元一世纪罗马人发明玻璃以来,人们就发现圆形的玻璃珠可以产生放大效果。后来,人们对这种效果进行了科学研究和进一步开发,从而产生了16和17世纪的简单放大镜,如汉斯和查卡里亚斯·简森或安东·范·列文虎克发明的简单放大镜。从历史上看,这是显微镜诞生的时刻。

根据定义,“显微镜”是一种可以放大人眼通常无法分辨的物体的仪器,因此这些单透镜工具已经是显微镜了(见图1上)。如今,当我们谈论显微镜时,我们想到的是不同的东西。这是因为人们很快就意识到,将两个单独的透镜(或透镜系统)组合成一排是比单透镜更有效的视觉工具。

为了描述这种装置,创造了“复式显微镜”这一术语。复式显微镜由一个可以放大标本的物镜和一个可以放大物镜产生的图像的目镜(分别有两个)组成(见图1中)。
 
图1:上:显微镜始于16和17世纪的简单放大装置。本例的物镜是一个可以放大标本的单透镜。中:有限远光学复式显微镜由双透镜系统组成。物镜放大标本,目镜放大物镜产生的图像。物镜安装定位面与目镜安装定位面之间的距离称为机械筒长。下:一个无限远光学复式显微镜带有一个额外的镜筒透镜(TL)。
 
无限远光学简介
物镜安装定位面与目镜安装定位面之间的距离称为机械筒长(见图1中)。为了标准化,19世纪时,英国皇家显微镜学会将这一数值设定为160毫米。多年来,这一设计被证实存在一些缺陷。在光路中添加额外的光学元件,例如用于微分干涉成像(DIC)的棱镜、偏振器等,会改变有效筒长并引入像差,这些必须通过添加其他硬件组件进行校正。

由于这个原因,20世纪30年代时,显微镜制造商徕卡开始用无限远光学进行实验,这项技术后来被所有其他显微镜公司采用。这些无限远光学系统的物镜将标本图像投射到无限远处,这意味着来自标本一个单点的所有光线都以平行的方式从物镜中发射出来。在标本(和物镜)中心的光线与光轴平行。在标本中心以外的光线相互平行,但不与光轴平行。

由无限远校正的物镜产生的虚像必须由一个附加透镜(镜筒透镜)捕捉,并进入到目镜透镜的前聚焦点(见图1下)。这种方法使DIC棱镜等光学仪器可以添加到物镜和镜筒透镜之间的“无限远空间”中,而不影响成像质量。图像的位置和聚焦点都没有改变(见图2)。
 
图2:上:有限远光学系统由物镜和目镜组成。物体被放置在物镜的单聚焦点和双聚焦点之间。物镜产生的中间图像在目镜的前聚焦点和目镜之间聚焦。用户可以通过目镜查看图像。下:在无限远校正系统中,标本被放置在物镜的聚焦点上。在这种情况下,从标本一个点射出的所有光线在物镜后面都是平行的,就像一个放置在无限远处的物体。从标本中心射出的光线经过物镜后平行于光轴(图中未显示)。从标本边缘一个点射出的光线经过物镜后彼此平行,但不与光轴平行。物镜与镜筒透镜之间的空间称为无限远空间。进入这个空间的平面光学装置几乎不会影响图像,因为从标本一个点射出的所有光线都会受到同样的光学影响。镜筒透镜形成的虚像可以通过目镜查看。

无限远光学的优点
几种光学对比法需要在显微镜的光路中引入特殊的光学元件。例如,用于DIC的棱镜和偏振器,或用于荧光显微镜的二向色镜和滤光片,对于相关技术而言都是必不可少的。在有限远光学显微镜的物镜和目镜之间引入这样的光学元件,改变了有效筒长,并引入了球面像差。这些可以通过引入额外的光学元件来校正,但代价是光强度较弱或放大倍数增加。

相比之下,无限远校正光学显微镜可以容纳用于光学对比法的额外设备,不会因将其引入到无限远空间中而造成光学损伤。安装在无限远光路中的装置既不会改变成像比例,也不会改变中间图像的位置。这是由于从标本的一个点射出的所有光线会平行穿过物镜。

从无限远光学中受益的不仅仅是整体图像质量。由于将不同的光学装置移动到无限远光路时,放大倍数不会发生变化,因此可以很容易地使用不同的光学对比法来比较完全相同的样品。例如,标本可以同时在DIC和荧光中成像(见图3)。

 
图3:DIC棱镜或荧光滤镜等光学装置,进入有限远光学的光路,损坏图像。必须通过使用额外的光学元件来确定引入的像差。这会增加物体的放大倍数。而引入无限远空间的光学元件对放大倍数没有影响。因此,DIC图像(左)和荧光图像(中)可以同时接收(右)。
 
除了少数例外,大多数显微镜都有一个物镜转盘,在转盘中,可以根据所需的放大倍数安装并更换不同的物镜。齐焦性允许用户在不同的物镜之间切换,而不需要重新聚焦标本。即使在无限空间中添加额外的光学仪器,也可以保持无限远光学的齐焦性。

如何让更多的装置进入无限远光路中
 
图4:一些显微技术要求同时耦合额外的光源或激光。例如,在FRAP实验过程中,通过将激光耦合到无限远光路中进行荧光漂白。
 
光学显微镜仍然是一个不断发展的领域。新技术的开发需要使用显微镜的光路,例如包括额外光源或激光装置。其中,荧光漂白后恢复技术(FRAP)需要激光对荧光基团进行漂白(见图4)。另一个例子是数字镜像器件,用于光遗传技术、光解笼锁和光漂白/激活。

无限远光学的引入为这些方法奠定了基础,因为其简化了必要组件通过无限远空间耦合到显微镜光路的过程。

到目前为止,人们已经发明了新的方法,可以使额外的装置进入到无限远光路中。从技术上看,有两种方式可以进入无限远空间:在物镜和镜筒透镜之间的成像路径,或在物镜和光源之间的照明路径(见图5)。通过成像路径进入的优点是,电动快速滤光片轮和快门等专用模块,可以非常容易地引入到显微镜中。

然而,应谨记,无限远空间(尽管其名字与其含义相反)不能通过将模块堆叠到显微镜中而无限延伸。原因是只有从标本中心射出的光线平行于光轴。

从标本一个点射出的偏离中心的光线彼此平行,但会以一定的角度照射到镜筒透镜上。从逻辑上讲,扩大物镜和镜筒透镜之间的成像路径会导致光损失。更准确地说,这会引起渐晕,并缩小视野。
 
图5:可以通过两种方法获取显微镜的无限远光路:物镜与管镜筒透镜(TL)之间的成像路径(上),或光源(L)与物镜之间的照明路径(下)。前一种方法需要将相关模块堆叠到显微镜中,从而延长了成像路径。第二种方法允许用户通过在照明路径中利用反射镜和分光器获取显微镜上的多个应用。
 
视频:徕卡DMi8无限远端口
通过显微镜的照明路径,例如通过徕卡无限端口,进入无限远空间,可以避免延长成像光路的问题(见图6)。除了保持图像质量外,该特性还具有通用性强的优点。只要有正确的适配器,任何装置都可以连接到显微镜上。特别是自定义产商,他们可以制造自己的装置,并将自己的装置与第三方和徕卡仪器连接,创建定制的成像解决方案。
 
图6:堆叠方法延长了显微镜成像的无限远光路。这可能会导致那些并非从标本中心射出的光线的损失。徕卡显微系统的无限远端口既不会延长成像光路,也不需要在成像光路中添加其他组件,这是堆叠系统的另一个缺点。
 
总结
无限远校正光学的引入极大改进了现代显微镜的功能。目前已不再需要校正光学对比法所需的棱镜或其他光学仪器引入的像差。无限远光学的易用性增加,除此之外,还允许多个光源同时耦合到显微镜中。
徕卡的无限远接口可以直接获取显微镜座的无限远光路,从而避免了堆叠方法产生的问题。这为研究人员打开了大门,使研究人员可以在不牺牲图像质量的情况下轻松连接其他光学装置,并跟上最新的显微镜趋势。

本文也发表于:Optik & Photonik,11卷,1期,34-37页,2016年2月
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