大家在做动物实验时往往会涉及到基因工程小鼠，离不开两个关键词：

      · Genotype（基因型）

      · Phenotype（表型）

    改变目标基因（Genotype），可能会导致小鼠某些生理过程的变化（Phenotype），从而推断目标基因的功能。Genotype 是因，Phenotype 是果。

      明确目标基因发生改变的过程叫Genotyping（基因型鉴定）。对于基因工程小鼠模型来说，就是区分野生型和突变型。发现并评估小鼠生理变化的过程叫Phenotyping（表型分析）。

     Genotyping是成就“因果关系”的基石。如果Genotyping出现差错，那么后续所有的Phenotyping都将谬以千里。因此，基因型鉴定是应用基因工程小鼠的过程中必不可少且至关重要的步骤，然而，做实验的过程中往往会出现一些意想不到的问题，就让我们一起学习一下基因鉴定的具体流程吧！

      选择正确的基因型鉴定方案，设计恰当的PCR引物，提取高质量的基因组DNA，做好对照，远离PCR污染等，这些都是基因型鉴定需要注意的问题。

      常用的基因型鉴定（ Genotyping）方法有聚合酶链式反应（PCR）+凝胶电泳或PCR+酶切或测序，本文主要介绍最常用的聚合酶链式反应（PCR）+凝胶电泳方法：

      基因工程小鼠基因型PCR 鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小（一般差异在100bp以上），根据电泳条带差异来直接区分小鼠的不同基因型。

       适用于：

       Knockout（包括CRISPR介导片段敲除）

       Conditional knockout

       Knock-in（片段敲入）

       主要流程如下图：

常规PCR电泳结果示意图：

01

剪取小鼠尾巴

      剪下老鼠0.5cm左右长度的尾巴或者耳朵或者称取20mg组织样本，将样本剪碎放在1.5ml的EP管中（视鼠龄及鼠尾粗细可调整, 尽量使鼠尾体积相互接近）。

      注：已剪下的鼠尾，如不即时鉴定，应存于-20℃冰箱中。

02

鼠尾消化

    每管中加入100-200微升NaOH溶液 (裂解液：50 mM NaOH+1 mM EDTA[也可不加])。现用现配，比如：1 N NaOH 以20倍稀释。

    加热至95℃ (90-100℃都可以)，持续60分钟(每20分钟时弹动一下EP管，使尾尖悬浮)；

    每管加入10-20微升Tris溶液 (中和液：1 M Tris-HCl, pH7.5)，涡旋混匀；高速离心30秒。 

    注：如不及时鉴定，应存于-20℃。

03

PCR扩增

       将获得的液体加入PCR混合液中，进行PCR扩增。PCR混合液的配制方法：ddH2O 9.5微升，Taq12.5微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升。每一个EP管中的总量是24微升，提取的DNA 只加1微升。将样品放入PCR仪扩增。也可购置商品化PCR Mix，PCR体系可依照商品说明书。

      注：须包含对照 - Wt, He，KO 等。

      PCR程序可依照商品说明书，以及引物和产物性质等做调整

      注：如不及时鉴定，应存于4℃冷藏室，不要-20℃冷冻。

     找到最适宜的退火温度。一般可以通过梯度PCR的方法，对退火条件进行摸索。退火温度梯度可以设为引物对Tm值上下5 ℃。Tm计算公式为：Tm = 4℃(G+C)+ 2℃(A+T)。

       如果没有扩增到预期的条带，可以降低退火温度帮助引物更有效地结合。如果非特异性条带很多，则可以提高退火温度来消除非特异性引物结合。

      多引物对的PCR不成功时，需要分开优化。如果PCR体系中存在多对引物同时反应，而最终未能扩增到PCR产物，那么要对每个引物对进行单独的PCR反应，从而调整优化整个体系。

      DNA过多或过少都会导致PCR不成功。一般模板浓度控制在50-100ng/µl 比较合适。

04

制胶

      将琼脂糖加入TEB溶液后微波炉加热3min，冷却后加入核酸染料，倒入制胶器制胶，30min后取出胶放入电泳槽中，黑线朝向正极。

05

加样、加Maker

06

电泳

      电泳液一般用1x TAE液。

      电压120伏，20-40 分钟。

04

观察、判断结果

      UV下观察、拍照，判断基因型结果。

08

注意事项

      1.在PCR实验前用75% 乙醇擦拭工作台、移液枪表面、手套。

      2.提取DNA的第一步中建议用小鼠的尾巴，优选小鼠尾巴，减轻动物疼痛且便于操作，鼠尾取样时，每一次剪鼠尾之前，都必须要用75%酒精擦拭清洁剪刀。或准备两把剪刀轮流使用，用完的剪刀浸泡在75%酒精溶液中。

      3.在标记过程中每一个EP管要标号无论盖子顶部还是管壁，都要做标记，因为要在水浴箱中进行裂解。

      4.在配裂解液的过程中，一般要多配出2份的量，因为在加样的过程中会有液体遗失，以防万一试剂缺如多配制2份。PCR试剂的分装。最好提前将去离子水、大包装的缓冲液等PCR试剂分装在1.5ml或1ml离心管中。避免原装瓶反复使用引起的污染。

     5.在制备PCR混合液的时候无论是上游还是下游引物总量都不能过多，否则显影的时候会出现引物二聚体，出现重影。

     6.使用离心机的时候要注意用常温的离心机，非4度，因为无论是裂解液还是无核酸酶水都是经过水浴箱55度温浴过的，所以，用常温的离心机即可。

     7.配置完成后要仔细盖紧PCR管盖。特别是使用像8联管这类PCR管，要检查盖子是否盖紧，以免导致在PCR机器里时水分蒸发。另外，配置后要轻轻混匀PCR体系并短暂离心，以免试剂黏在试管壁上导致反应不充分。

     8.配制 PCR 反应体系的实验台尽量和 PCR 仪以及电泳槽分开，因为 PCR 仪和电泳槽附近的区域往往是高浓度 DNA 弥散的区域。

     9.跑电泳过程中，上样的枪头最好及时更换。如果没有更换，那么每次上完一个样都要在电泳 buffer 中吹打清洗干净。防止枪头上带有前一个样品的产物，造成点样的污染。

     10.利用qPCR排除假阳性。在鉴定 Cre 和 Flp 这些转基因小鼠的时候，可以尝试通过荧光定量 PCR 做相对定量的方法来避免假阳性的问题。具体是指在荧光定量PCR的时候，同时鉴定目的基因和内参基因，通过△Ct的方法来确定阳性产物，可以有效避免因为少量污染造成的假阳性问题。