中性粒细胞(图1A)是人类最丰富的白细胞，是先天免疫系统的重要组成部分，占人类所有白细胞的40%至70%。中性粒细胞由骨髓中的干细胞形成(图1B)，并分化成嗜中性粒细胞和嗜中性粒细胞钙化细胞亚群。中性粒细胞是一种吞噬细胞，同时也是急性炎症的标志，具有趋化、吞噬和杀菌作用。另外，中性粒细胞也可通过直接杀死肿瘤细胞和参与介导抗肿瘤抵抗的细胞网络来介导抗肿瘤反应，调节肿瘤免疫微环境。因此，中性粒细胞有望成为未来肿瘤等疾病治疗的重要靶标。
在单细胞分辨率下的研究中，中性粒细胞不容易被检测到，具体原因有以下两点：①中性粒细胞脆弱、寿命短，在人体内半衰期为7-10小时，对处理过程要求的技术水平相对较高；②中性粒细胞中表达的mRNA分子量低。所以，针对中性粒细胞的单细胞测序有一些挑战。
 为了高分辨率地剖析非小细胞癌(NSCLC)肿瘤微环境，Salcher等在文章“High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer”中整合了来自19个研究中的505个单细胞NSCLC肿瘤和健康人源样本，并注释出12种细胞类型(图2A)。对比不同测序平台细胞亚群的组成分析结果，新格元GEXSCOPE®单细胞测序平台(以下简称GEXSCOPE)采取微流控微孔法分离和捕获细胞，更加温和，可以检测出符合预期的中性粒细胞。
  包括T细胞，NK细胞，传统树突状细胞，基质细胞，上皮细胞，B细胞，血浆树突细胞，效应B细胞，肥大细胞，中性粒细胞，内皮细胞和巨噬细胞
 
案例一、解析晚期NSCLC的肿瘤微环境内中性粒细胞特征
在文章“Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer”中，作者分析了42例III/IV期NSCLC患者的穿刺样本，将肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、驱动基因突变与野生型等多种类型的肿瘤组织进行比较，呈现了晚期NSCLC的大规模、单细胞分辨率的肿瘤组织微环境图谱，并对肿瘤组织进行异质性分析。其中，捕获到中性粒细胞的样本所占比例为0.05%-50.62%，具有高度的异质性。在17种样品中，所占比例不到5%，说明GEXSCOPE对中性粒细胞的捕捉非常敏感，即使比例较低，也能检测到。
在本研究中，作者对LUAD病人进行了细胞成分及肿瘤亚型相关分析，发现LUAD病人的中性粒细胞数量明显下降，并且中性粒细胞在肿瘤中的浸润程度与ITHGEX评分成正比。此前，其他NSCLC研究证实，肿瘤微环境的差异会导致LUSC患者的中性粒细胞比LUAD更多，并且肿瘤组织中高活性粒细胞数量和肿瘤内高度异质性是导致肿瘤免疫疗效差的重要原因。文章进一步弥合了高嗜中性粒细胞含量和高肿瘤异质性之间的相关性，从一个全新的角度来探讨NSCLC中中性粒细胞的生物学特性，并为中性粒细胞在NSCLC及免疫治疗中的潜在功能研究提供理论依据[2]。
案例二、通过GEXSCOPE揭示STZ诱导的1型糖尿病小鼠中性粒细胞与骨髓与骨质减少关系紧密
1型糖尿病(T1D)是一种多因素自身免疫性疾病。尽管T1D患者出现骨量下降及骨组织破坏等一系列临床症状，但T1D致骨量下降的分子机理尚不清楚，猜测与骨髓中的炎症反应相关。在文章“Single-cell RNA sequencing analysis reveals the relationship of bone marrow and osteopenia in STZ-induced type 1 diabetic mice”中，作者建立了链脲佐菌素(STZ)诱发的T1D小鼠模型(D)，并以健康小鼠(C)为对照，对两组小鼠股骨和胫骨的全骨髓细胞进行单细胞测序。研究结果显示，两组小鼠的细胞占比存在显著的不同，D组小鼠中BM-中性粒细胞比例显著增加。
进一步研究显示，中性粒细胞cluster1在糖尿病患者血清中显著富集于成骨细胞分化、IL-17信号通路和TNF信号通路。这个结果也与健康和STZ诱导的T1D小鼠之间上调的DEGs的KEGG分析相一致。这些结果表明，中性粒细胞cluster1可能密切涉及T1D和T1D诱发的骨质疏松的病理过程，提示中性粒细胞与糖尿病患者的骨量下降关系紧密。研究者们利用D组和C组的细胞比例信息分析了组间差异，发现中性粒/B细胞比率与T1D模型的骨量呈正相关。据此，文章提出了外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)升高是由骨髓NLR升高引起的假说[3]。
     
案例三、通过GEXSCOPE研究排卵前卵泡微环境的内在异质性
卵泡微环境，包括卵泡内颗粒细胞(GCs)，负责卵母细胞成熟和随后的排卵。然而，卵泡微环境中的GCs和细胞成分在排卵前卵泡中的功能尚未被广泛探讨。文章“Single-Cell Sequencing Reveals an Intrinsic Heterogeneity of the Preovulatory Follicular Microenvironment”在单细胞分辨率下调查了体外受精中六个人类排卵前卵泡中MII卵母细胞周围卵泡微环境。如图5-1/2所示，作者展示了来自所有样本的14,592个高质量细胞的UMAP图和六种细胞类型中特征基因的表达模式，包括颗粒细胞(GCs)、巨噬细胞、树突状细胞(dc)、T细胞、上皮细胞和中性粒细胞。通过研究巨噬细胞、dc、T细胞和中性粒细胞之间趋化因子的相互作用(图5-3)，文章发现了巨噬细胞的浸润和富集在GC功能的调节和DCs、T细胞和中性粒细胞的募集中起着关键作用。最终，文章鉴定了排卵前卵泡中颗粒细胞以及其他细胞类型的不同功能簇，揭示了排卵过程中GC中特定基因的动态，并揭示了主要细胞类型(包括各种免疫细胞类型)之间潜在的细胞相互作用[4]。
 
此外，GEXSCOPE在多个研究中都辅助解析了免疫细胞景观：Zhang等通过对慢性乙肝肝衰竭患者(CLF)、1个日本血吸虫合并乙肝患者(SJ)及2个健康人(HC)肝组织中的肝脏非实质细胞(NPCs)进行了高通量单细胞测序，鉴定肝内浸润的免疫细胞类型和状态，以探索血吸虫病肝组织中发生肝纤维化的免疫机制，揭示了疾病组与对照组之间免疫微环境的异质性，其中也包括中性粒细胞的异质性[5]。Kong等通过对肾移植后慢性抗体介导排斥反应(cABMR)发生和发展过程中免疫细胞的单细胞转录组测序，揭示了cABMR中强烈的T/B细胞和中性粒细胞激活，阐明了cABMR的免疫全景和致病性免疫应答以及cABMR临床治疗的潜在治疗策略的意义[6]。
作为一家拥有一站式单细胞解决方案的公司，新格元拥有独立开发单细胞测序系统的研发、产品和服务团队。在对多种组织样本中的中性粒细胞的采集、分析、标注等方面有着丰富的项目经验积累，能够在单细胞水平上发现单个细胞所特有的细微改变，发现新的细胞种类，并进行肿瘤异质性的鉴别，为深入理解生命活动与疾病发生发展提供新的思路。单细胞转录组测序分析可能为中性粒细胞相关的研究提供另一个全面的视角，从细胞学水平上揭示中性粒细胞在多种疾病发生发展过程中的功能，并为临床靶向治疗、数据挖掘等研究奠定细胞分子生物学基础。

参考文献
[1]Salcher S, Sturm G, Horvath L, et al. High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 2022 Dec 12;40(12):1503-1520.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2022.10.008. Epub 2022 Nov 10. PMID: 36368318; PMCID: PMC9767679.
[2]Wu F, Fan J, He Y, Xiong A, Yu J, et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer. Nat Commun. 2021 May 5;12(1):2540. doi: 10.1038/s41467-021-22801-0. PMID: 33953163; PMCID: PMC810017
[3]Zhong J, Mao X, Li H, Shen G, et al. Single-cell RNA sequencing analysis reveals the relationship of bone marrow and osteopenia in STZ-induced type 1 diabetic mice. J Adv Res. 2022 Nov;41:145-158. doi: 10.1016/j.jare.2022.01.006. Epub 2022 Jan 21. PMID: 36328744; PMCID: PMC9637485.
[4]Wu H, Zhu R, Zheng B, et al. Single-Cell Sequencing Reveals an Intrinsic Heterogeneity of the Preovulatory Follicular Microenvironment. Biomolecules. 2022 Jan 29;12(2):231. doi: 10.3390/biom12020231. PMID: 35204732; PMCID: PMC8961562.
[5]Zhang Y, Li J, Li H, et al. A preliminary investigation into the immune cell landscape of schistosome-associated liver fibrosis in humans. Immunol Cell Biol. 2021 Sep;99(8):803-813. doi: 10.1111/imcb.12490. Epub 2021 Aug 6. PMID: 34355810; PMCID: PMC8456952.
[6]Kong F, Ye S, Zhong Z, Zhou X, et al. Single-Cell Transcriptome Analysis of Chronic Antibody-Mediated Rejection After Renal Transplantation. Front Immunol. 2022 Jan 17;12:767618. doi: 10.3389/fimmu.2021.767618. PMID: 35111153; PMCID: PMC8801944.