全面解答：细胞培养常见问题及其解决方法的详细介绍
2023-09-04 来源:本站 点击次数:1936
细胞培养常见问题及其解决
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。*-20 °C 不可超过 1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。
17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
21. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
22. 支原体污染会对细胞培养有何影响？
27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
40. 在重新冻存 sf9 细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
42. 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？
47. 保存血清最好的方法?
1. 如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，首选 MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2. 何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。
4. 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5. 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
6. 培养细胞时应使用 5 % 或 10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统， 而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10 %CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时， 则应使用 5 % CO2 培养细胞。
7. Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要 CO2 培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和 Earle's 平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在 Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡，以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的 CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在 CO2 培养箱中会变酸。如果希望在 CO2 培养箱中保存组织，需要用 Eagles 液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用 Hanks 液就可以了。
8. 细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
9. 悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。
10. 冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后， 须立即放入 37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。
11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除 DMSO？
除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
12. 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。
13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞， 其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。
14. 细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将 DMSO直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。
15. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之 DMSO 等级， 必须为 Tissue culture grade 之 DMSO (如 Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4°C，避免反复冷冻解冻造成 DMSO之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO， 则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜。
16. 冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于 4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) →液氮槽 vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。*-20 °C 不可超过 1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。
17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
18. 培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
19. 应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
20. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
原则上：直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查 HEPA 过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素 B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素 B 推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4. 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度 2～3 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞 2～3 代。
5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6. 重复步骤 4。
7. 在无抗生素的培养基中培养 4～6 代，确定污染是否以已被消除。
21. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
22. 支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
25. 为何培养基保存于 4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且 pH 值会越来越偏碱性？
培养基保存于 4 °C 冰箱中， 培养基内之 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为 phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之 CO2， 以调整 pH 值。
26. 各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？
不同厂牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。
27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
28. 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。
30. L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
31. GlutaMAX-I 是什么？培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放 L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I 二肽非常稳定，即使在 121 磅灭菌 20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
32. 什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中用作 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
33. 如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200～2000 个/毫升，在 0.1 毫升细胞悬液中加 0.1 毫升 0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。
34. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
35. 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么？
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用 EDTA 清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
36. 室温下配制的 Tris-HCl 溶液，在 37℃使用时 PH 值是多少？
缓冲液 PH 值随温度变化而变化。下表列出了 50mM Tris-HC 溶液在 4℃，25℃，37℃时，不同 PH 值。50mM Tris-HC 溶液在 4℃，25℃，37℃时，不同 PH 值
| 4℃ | 25℃ | 37℃ |
| 8.1 | 8.5 | 7.2 |
| 8.2 | 7.6 | 7.3 |
| 8.3 | 7.7 | 7.4 |
| 8.4 | 7.8 | 7.5 |
| 8.5 | 7.9 | 7.6 |
| 8.6 | 8 | 7.7 |
| 8.7 | 8.1 | 7.8 |
| 8.8 | 8.2 | 7.9 |
| 8.9 | 8.3 | 8 |
| 9 | 8.4 | 8.1 |
| 9.1 | 8.5 | 8.2 |
| 9.2 | 8.6 | 8.3 |
| 9.3 | 8.7 | 8.4 |
| 9.4 | 8.8 | 8.5 |
37. 如何从 T25 瓶中转移 sf9 细胞？能用胰蛋白酶消化吗？
我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。
38. 胰酶消化一个 T25 瓶的 sf9 细胞：
38. 胰酶消化一个 T25 瓶的 sf9 细胞：
1. 去除培养基。
2. 用 2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除 PBS。
3. 加入 2ml 1x 胰酶 EDTA（恰好覆盖细胞表面）。
4. 37 ℃孵育 5 到 10 分钟。在仪器下检测看到 5 分钟后它们正在向上移动。
5. 向细胞中加入 2ml 细胞培养液，移入锥形管，用 2ml 培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的 FBS 终止了胰酶的活性。）
6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
39. 在 Sf9, Sf21, 和 high Five 细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为 10 单位/毫升细胞悬液。
40. 在重新冻存 sf9 细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过 30 次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过 95％的细胞保持有活力和在大约 30 小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。
41. 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫？
这主要是由于在暴露到周围的 CO2 水平时，碳酸氢纳导致了 pH 值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在 CO2 培养箱孵育培养基 10-15 分钟，来校正溶液的 pH 值（确定松开瓶口以保证气体交换）。
42. 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？
如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。
43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？
当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。
44. 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？
一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
45. 培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？
大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。
大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。
46. 为什么要在溶解的一周内使用贮存在 4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?
胰蛋白酶在 4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过 30 分钟，就会变得不稳定。
47. 保存血清最好的方法?
我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于 4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?
将血清从冷冻箱取出后，先置于 2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。
若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以 400g 稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。
50. 为什么要热灭活血清?
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养 ES 细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
51. 有必要做热灭活吗?
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!
52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
有些胎牛血清产品没有预老化，储存在 2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
53. 如何避免沉淀物的产生?
53. 如何避免沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:
(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至 4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至 37℃)，非常容易产生沉淀物。
(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。
(3)请勿将血清置于 37℃太久。若在 37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。
(5)若必须做血清的热灭活，请遵守 56℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
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