组织块培养法提取原代细胞的步骤介绍
2023-09-14 来源:本站 点击次数:1804
组织块培养法：
1.提取组织：这一步，如果是动物的组织，并不是所有的实验室都可以把小鼠拿到生物安全柜进行解剖的，所以如果是在生物安全柜外的地方提取组织，那就注意以下几点：
I.准备冰盒，5%双抗的PBS，培养皿。将培养皿盛适量5%双抗的PBS，置于冰上
II.确认目标组织的位置和大小，精确分离。如果这点都错了，那提出来的细胞也并非你所要的细胞了，一切努力就白费了。所以务必保证自己分离的组织是对的。尽量去除多余的组织，以保证细胞纯度。
III.解剖所用的器械提前进行高压灭菌，减少污染可能。
2.冲洗组织：用冰盒将提取的组织转移至生物安全柜或超净台，如果需要用到器械，那就要用另一套经高压灭菌的器械，和上面提取组织的器械分开，用5%双抗的PBS快速冲洗3遍，这里的冲洗要注意，用巴氏管或1ml移液枪，对着组织吹打才叫冲洗。
3.剪碎组织：大小为1mm3，这一步也不可小觑，组织太大，不容易黏附在皿或瓶中。在20%或10%FBS的培养基中进行。
4.平铺组织：将组织平铺于6孔板或培养皿中，这时候protocal就说，加入少量培养基，浸没组织，但又不能使组织漂浮。这里有个小技巧，有些教程会说到，加入培养基后，倾斜培养瓶，这个是可以使组织贴于瓶或皿中的，倾斜多久呢？我觉得1-4h左右就可以，然后缓慢，一定要缓慢放平，使培养基缓慢浸没组织，然后再重新放入培养箱中。我是用6孔板铺的组织，然后加入300-400ul培养基，放入培养箱中4h后，缓慢！再加入500ul培养基。我觉得这个要做几次，自己多感受一下，才能把握住量。
5.等待：我拿到的protocal是说48h后细胞会缓慢长出，但是这里劝告大家，protocal毕竟是protocal，并不适用于每个人，我做了几次48h后发现没有细胞长出就丢了，现在想想真是追悔莫及，不过也算是学习了。我的组织，等到了72h甚至96h后，组织周围！这里又让我这个实验小白吃了亏，没人教，误以为是组织块以外的地方才能看见细胞，但是组织块培养法就是细胞从组织中爬出来的，所以观察组织块及周围，才能看见细胞。至于其他地方的一些黑点，估计是组织碎片，只要不是污染，就无需在意。所以组织块培养法，大家要耐心等待，细胞长出少许也不要急着丢弃组织，可以等细胞再多一些，但是如果组织块已经漂浮起来了，那就可以丢弃了。
6.换液和传代：观察细胞的生长，长至80%左右进行传代培养，消化时间不要过长，容易损伤细胞。
1.提取组织：这一步，如果是动物的组织，并不是所有的实验室都可以把小鼠拿到生物安全柜进行解剖的，所以如果是在生物安全柜外的地方提取组织，那就注意以下几点：
I.准备冰盒，5%双抗的PBS，培养皿。将培养皿盛适量5%双抗的PBS，置于冰上
II.确认目标组织的位置和大小，精确分离。如果这点都错了，那提出来的细胞也并非你所要的细胞了，一切努力就白费了。所以务必保证自己分离的组织是对的。尽量去除多余的组织，以保证细胞纯度。
III.解剖所用的器械提前进行高压灭菌，减少污染可能。
2.冲洗组织：用冰盒将提取的组织转移至生物安全柜或超净台，如果需要用到器械，那就要用另一套经高压灭菌的器械，和上面提取组织的器械分开，用5%双抗的PBS快速冲洗3遍，这里的冲洗要注意，用巴氏管或1ml移液枪，对着组织吹打才叫冲洗。
3.剪碎组织：大小为1mm3，这一步也不可小觑，组织太大，不容易黏附在皿或瓶中。在20%或10%FBS的培养基中进行。
4.平铺组织：将组织平铺于6孔板或培养皿中，这时候protocal就说，加入少量培养基，浸没组织，但又不能使组织漂浮。这里有个小技巧，有些教程会说到，加入培养基后，倾斜培养瓶，这个是可以使组织贴于瓶或皿中的，倾斜多久呢？我觉得1-4h左右就可以，然后缓慢，一定要缓慢放平，使培养基缓慢浸没组织，然后再重新放入培养箱中。我是用6孔板铺的组织，然后加入300-400ul培养基，放入培养箱中4h后，缓慢！再加入500ul培养基。我觉得这个要做几次，自己多感受一下，才能把握住量。
5.等待：我拿到的protocal是说48h后细胞会缓慢长出，但是这里劝告大家，protocal毕竟是protocal，并不适用于每个人，我做了几次48h后发现没有细胞长出就丢了，现在想想真是追悔莫及，不过也算是学习了。我的组织，等到了72h甚至96h后，组织周围！这里又让我这个实验小白吃了亏，没人教，误以为是组织块以外的地方才能看见细胞，但是组织块培养法就是细胞从组织中爬出来的，所以观察组织块及周围，才能看见细胞。至于其他地方的一些黑点，估计是组织碎片，只要不是污染，就无需在意。所以组织块培养法，大家要耐心等待，细胞长出少许也不要急着丢弃组织，可以等细胞再多一些，但是如果组织块已经漂浮起来了，那就可以丢弃了。
6.换液和传代：观察细胞的生长，长至80%左右进行传代培养，消化时间不要过长，容易损伤细胞。
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