01
电穿孔介导的受精卵基因编辑

如今，将基因编辑物质递送至牲畜受精卵的普遍方法是显微注射技术(microinjection ，MI)。这种方法需要昂贵的设备和较高能力要求的技术人员，通过人工一个一个给受精卵注射基因编辑物质，可以对单个受精卵进行特异性的操作，但过程费时费力。且容易导致显微注射与受精的时间间隔差异较大，同时由于过分依赖操作者，可能会给基因编辑实验引入不必要的变量。
电穿孔技术提供了一种将基因编辑物质传递的新方法。现今大量实验中会使用电穿孔技术转染培养的细胞，同时电穿孔技术也被应用于有效地将基因编辑物质传递到小鼠和大鼠的受精卵中。
电穿孔技术需要的设备仅为电穿孔仪和适宜的电极，将受精卵置于电极杯中或载玻片电极上，悬浮在含有基因编辑试剂的培养基中，电穿孔仪通过电极引导电流脉冲通过受精卵，在受精卵的透明带和质膜上产生暂时性的微孔，从而使基因编辑试剂通过微孔进入受精卵中，进而发挥作用。利用电穿孔的方式可以一次性处理35-100个受精卵，与显微注射技术相比，电穿孔介导的基因编辑试剂的递送效率大大增高。

 

02
哺乳动物受精卵电穿孔条件及优化

由于电穿孔技术操作简单且效率高，它将成为在家畜物种中实现高通量基因编辑的重要技术支撑。然而，为了获得高存活率和高效基因编辑受精卵，我们需要对电穿孔参数进行物种特异性的优化，并且有针对性的进行应用。
过往的研究表明，更高的穿孔电压、更长的脉冲时间和更高的 Cas9/sgRNA 浓度都可以使基因编辑效率提高，但会使受精卵的活力降低。在优化电穿孔条件时，需要在基因编辑效率和受精卵活力之间寻找平衡。不同电穿孔实验中的最有效参数高度依赖于受精卵的种类、具体基因编辑类型（敲除或敲入）以及靶基因，因此，在不同实验中有必要优化电转条件中的相关参数，从而最有效地获得基因编辑过的动物。

03
应用实例

实例：使用BEX的CUY21EDIT II 电穿孔仪，通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到受精卵中，高效生成胰岛素( INS )基因突变猪

日本德岛大学生物科学与生物工业学院2023 年 1月发表的《Pigs with an INS point mutation derived from zygotes electroporated with CRISPR/Cas9 and ssODN》研究中，开发了一种使用 CRISPR/Cas9 系统通过电穿孔将点突变引入猪受精卵中以生成胰岛素基因突变猪，从而为胰岛异种移植提供合适的供体。

猪的解剖学特性和生理学特性与人类非常相似，所以转基因猪有望成为理想异种移植器官的供体。正因如此，为了保护猪胰岛免受宿主免疫系统的影响，对胰岛微囊化和基因修饰的研究也正在展开开展。猪胰岛素与人胰岛素的区别在于B链羧基末端的一个氨基酸(猪的丙氨酸和人的苏氨酸)。将猪胰岛素(INS)基因给定位置上的一个单核苷酸转换(引入点突变)，使密码子54的G变成A (GCC，编码丙氨酸；ACC，编码苏氨酸)，从而可以将猪的胰岛素转化为人的胰岛素，使基因工程猪能产生并分泌人胰岛素，从而建立胰岛异种移植的适宜供体。

在猪中，点突变要么通过基因编辑器和 ssODN 显微注射到受精卵/胚胎中，要么通过使用基因编辑体细胞的体细胞核移植 (SCNT) 技术引入。然而，目前还没有关于通过电穿孔产生点突变猪的相关文章。本研究中使用GEEP（gene editing by electroporation of Cas9 protein）方法优化了 HDR 介导的将精确点突变引入猪受精卵INS靶区，并生成了具有INS点突变的猪。

其中，GEEP的电穿孔操作为：将猪受精卵被放置在无核酸酶双工缓冲液(含有100 ng/μl靶向猪INS基因的gRNA、100 ng/μl Cas9蛋白和16 pmol/μl ssODN)中，置于电极（LF501PT1-20；BEX）间隙中并排成一条线。此后，使用 CUY21EDIT II 电转仪 (BEX) 对受精卵进行电穿孔（25 V 的五个 1 毫秒脉冲）。电穿孔后，受精卵在PZM-5中培养12小时直至胚胎移植；或在PZM-5中培养3天，然后在猪囊胚培养基中培养4天，以检测囊胚的基因型以及受精卵的发育能力。

将带有 1 μM Scr7 的 40-bp 同源的 gRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 电穿孔到受精卵中，使用深度测序分析所得转基因囊胚的基因型以评估嵌合性，如图1。13个囊胚中的4个携带镶嵌突变，包括所需的点突变等位基因。13个囊胚中的2个以双等位基因方式携带所需的点突变。

图 1 对囊胚中的INS靶区进行深度测序分析。gRNA 的目标序列和 PAM 序列分别以蓝色和红色表示。插入和修改的序列分别用绿色和粉色表示。

之后将带有 1 μM Scr7 的 40-bp 同源的 gRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 电穿孔到受精卵中，然后将它们转移到两个受体母猪的输卵管中。一个受体母猪的每个输卵管被移植了100个胚胎，两只母猪都怀孕了，并生下了5只小猪。在耳活检中对INS基因区域的目标位点进行的深度测序分析表明，所有幼猪都携带INS突变，如图2。 图 2 仔猪耳部活检INS靶区的深度测序分析。gRNA 的目标序列和 PAM 序列分别以蓝色和红色表示。插入和修改的序列分别用绿色和粉红色表示。

本研究开发了一种通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到受精卵中来生成具有所需点突变转基因猪的新方法，避免了耗时且复杂的显微操作。通过基因编辑形成的点突变成功地遗传给了下一代F1，通过将电穿孔介导的点突变引入受精卵成功地建立了用于猪到人异种移植的胰岛供体。然而本研究中，引入点突变的效率仍然较低，在未来猪受精卵和胚胎中对HDR 介导的基因修饰的实际操作方法仍需要更多的优化。

04
总结

受精卵基因编辑技术现今被用于以多种方式提高相关产业的牲畜生产力和经济效益。电穿孔可以简化产生转基因模式动物与转基因牲畜的过程，并使缺乏显微注射技术条件的实验室将基因编辑试剂快速传递到哺乳动物的受精卵中，更便捷地进行受精卵基因编辑。但这一技术仍需要进一步探索和优化，针对不同物种和不同靶基因进行更多的实践操作，从而在家畜中更高效更快捷地进行非嵌合基因敲除和靶向基因插入。

产品介绍

日本BEX公司新CUY21EDITII电转化仪可满足活体、受精卵、贴壁细胞、悬浮细胞以及难转染细胞的高效基因导入。由成立于1990年的活体转基因技术及细胞融合技术全球领导者——BEX公司推出。采用先进的脉冲技术，支持恒流输出、动态衰减脉冲和反转脉冲模式，是一款无需专用试剂的全功能多模式活体细胞转染仪器，目前已广泛应用于全球实验室。

CUY21EDITIl可应用于细胞和组织的高效转染，尤其适合于原代细胞、免疫细胞、干细胞等难转染细胞的高转化率和高存活率转化。同时，CUY21EDITIl还可应用于贴壁细胞、离体受精卵及活体的基因转染，根据不同实验需求选择相应电极进行体内体外的转染。

参考文献：

[1] Tanihara, F., Hirata, M., Namula, Z., Do, L. T. K., Yoshimura, N., Lin, Q., Takebayashi, K., Sakuma, T., Yamamoto, T., & Otoi, T. (2023). Pigs with an INS point mutation derived from zygotes electroporated with CRISPR/Cas9 and ssODN. Frontiers in cell and developmental biology, 11, 884340. https://doi.org/10.3389/fcell.2023.884340 

[2] Raza SHA, Hassanin AA, Pant SD, Bing S, Sitohy MZ, Abdelnour SA, Alotaibi MA, Al-Hazani TM, Abd El-Aziz AH, Cheng G, Zan L. Potentials, prospects and applications of genome editing technologies in livestock production. Saudi J Biol Sci. 2022 Apr;29(4):1928-1935. doi: 10.1016/j.sjbs.2021.11.037. Epub 2021 Nov 24. PMID: 35531207; PMCID: PMC9072931.

[3] Lin, J. C., & Van Eenennaam, A. L. (2021). Electroporation-Mediated Genome Editing of Li