水稻被认为是世界上重要的作物之一，由于无法获得特定的抗病毒药物，水稻病毒管理面临重大挑战，需要及早进行田间检测。目前，检测水稻病毒的主要方法包括电子显微镜、血清学检测和分子生物学技术，如逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 和实时荧光定量PCR。血清学方法虽然被广泛使用，但往往灵敏度较低，导致频繁的假阴性。电子显微镜和先进的分子技术都需要专门昂贵的设备，如电子显微镜和热循环仪，以及熟练的实验室人员，这限制了它们的广泛应用。

基于核酸诊断的出现引入了重组酶聚合酶扩增 (RPA) 和环介导等温扩增 (LAMP) 检测等创新方法。这些测定通常使用专门设计的引物进行，以识别靶标的独特序列，在等温条件下运行，无需热循环。特别是LAMP已被证明可有效识别各种水稻病毒，包括RRSV、RBSDV和RGSV。尽管RPA和LAMP都适合进行现场检测，但它们的灵敏度过高，容易受到污染，并且在现场环境中执行单管多重检测时面临困难。

CRISPR/Cas 系统作为核酸检测诊断的有效技术，巧妙地克服了与等温扩增技术相关的局限性，基于CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a开发的平台已被证明可以在即时环境中快速、灵敏和特异性地检测广谱病原体，包括病毒RNA和DNA。然而，CRISPR-Cas检测技术一直存在各种限制，例如原间隔区相邻基序 (PAM) 或原间隔区侧翼序列 (PFS) 的限制检测序列以及与多重目标检测相关的问题。

而与Cas核酸酶相比，某些pAgo蛋白具有序列特异性结合和切割靶DNA和RNA的能力。它们不受靶DNA中PAM序列存在的限制，因此在靶核酸选择方面提供了更大的灵活性。与需要长RNA向导的Cas核酸酶相比，大多数pAgo蛋白使用短DNA分子作为向导。鉴于DNA合成相对于RNA的经济性和稳定性优势，它促进了基于Ago的核酸检测系统的发展。与Cas9相比，由于它们的分子量较低，修饰和生产相对容易。

此外，它们还可以切割特定的底物序列，能够检测多个靶标，这些靶标已被转化为各种新型核酸检测例如Argonaute (TtAgo) 已被设计用于在PCR扩增后富集稀有核酸。同样，在病毒检测领域，Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo) 系统切割已被用于促进对各种病毒的序列特异性检测，如人瘤病毒、SARS-CoV-2和流感病毒。

近期中国计量大学孙凯团队开发了一种高度特异性和灵敏度的方法，结合 PfAgo 和等温 RPA 扩增(RT-RPA-PfAgo)，同时检测多种病毒，该方法在特异性、灵敏度和重现性方面优于RT-PCR，灵敏度范围为 3.13 至 5.13 copies/μl。这项创新技术有望在各种植物病毒中具有潜在的适用性，从而能够加快病毒核酸序列的鉴定。

RT-RPA-PfAgo 方法的原理
如Figure 1 所示，RT-RPA-PfAgo检测的机制始于特定片段的 RT-RPA，然后在 5′-磷酸化 gDNA 的引导下，通过 PfAgo蛋白特异性鉴定扩增的片段。在gDNA和RPA扩增子的一条链之间进行碱基配对时，PfAgo触发了靶DNA的10和11碱基之间的磷酸二酯键，这导致了新的5′-磷酸化ssDNA的形成，能够作为随后PfAgo切割的引导gDNA， 靶向合成设计的单链 DNA 探针，该探针在其末端用荧光团和淬灭基团标记。FAM 和 BHQ1 由于探针末端序列的发夹状结构，因为它们具有互补性，因此保持在附近。探针的环序列被设计为与新生成的 5′-磷酸化ssDNA配对，从而通过PfAgo启动特异性探针切割，释放荧光团，随后通过荧光法检测荧光团。由不同靶标片段产生的独特二级gDNA可指导PfAgo切割具有不同荧光标记的特定探针，从而能够在单个反应中同时检测多个靶标。这种双重识别和切割过程增强了该方法的特异性和准确性，大大减少了潜在的假阳性结果。
通过RT-RPA-PfAgo建立RRSV检测工作流程
研究者基于凝胶电泳分析、荧光探针、视觉荧光等技术构建了检测工作流程。这些结果肯定了RT-RPA-PfAgo方法在检测RRSV基因方面的有效性，并突出了其在病毒诊断领域的精确性和潜在适用性。 (A) gDNA的示意图和为RRSV检测量身定制的指定探针。PfAgo 切割区域和新形成的次级 gDNA 以红色突出显示。三个 5’ 磷酸化的单链 DNA 向导以紫色、绿色和黄色阴影描绘。分子信标以蓝色表示和强调。(B) PfAgo 介导的 RT-RPA 衍生扩增子上的切割活性图示，如在 3% TAE 凝胶上所示。(C) 蓝光透射仪下阳性样品的视觉荧光。(D) 通过RT-RPA-PfAgo方法对RRSV的荧光检测显示为荧光曲线。NTC：无模板对照。

RT-RPA-PfAgo反应的优化
为了提高RT-RPA-PfAgo反应的效率，关键组分的浓度，即Mn2+的浓度、gDNA 和 PfAgo 进行了优化。结果表明，Mn2+浓度为0.8 μM时， gDNA 浓度为 2 μM 浓度时、2 μM的PfAgo被确定为最有效的浓度。优化条件下的峰值荧光值在 PfAgo 切割后 30 分钟内一致显示，从而为所有后续反应选择 30 分钟的持续时间。 (A–C) 图说明了荧光强度的时间积累，每个图对应于不同浓度的Mn2+gDNA 和 PfAgo。(D-F) 描述终点荧光信号的条形图，具有不同浓度的 Mn2+、gDNA 和 PfAgo。包括误差线，以指示三个重复中的标准误差。RRSV RNA标准品，浓度为104在这些实验中，每个反应的copies数被用作模板。

使用RT-RPA-PfAgo系统同时检测RRSV、RGSV和RBSDV
基于PfAgo特异性的引导定向切割能力，进一步完善和增强了RT-RPA-PfAgo方法，实现了病毒RNA靶标的多重检测。靶向三个特定基因片段，通过设计多重RT-RPA引物、原代gDNA和相应的探针实现了多重病毒核酸检测。当该方法在 50 分钟内检测到 RRSV 的低浓度为 3.13 copies/μl、RGSV 的 4.13 copies/μl 和 RBSDV 的低浓度为 5.13 copies/μl时 。该方法在单次反应中检测到单靶标、双靶标和三靶标，在任何反应组合中均未出现脱靶信号，并且多重反应中的信号强度保持均匀。 (A) PfAgo 介导的 RT-RPA 扩增子上的裂解，如在 3% TAE 凝胶上观察到的那样。(B-D) 分别使用连续稀释的 RRSV、RGSV 和 RBSDV 进行三重荧光分析的检测限 (LoD) 测定。图中的误差线表示从三次重复计算出的标准偏差。(E) 描述RRSV、RGSV和RBSDV的RT-RPA-PfAgo荧光检测的正交特异性的热图。(F) 使用RNA靶标的混合物进行三重荧光分析。热图的颜色强度对应于在三次重复中观察到的平均荧光强度。

通过RT-RPA-PfAgo进行现场样品分析
为了评估三重RT-RPA-PfAgo测定对田间样品的疗效，在不同地区收集了22份水稻叶组织样本同步检测。研究结果表明，RT-RPA-PfAgo 和 RT 方法之间完全一致 (100%) (Figure 5) 。这些结果提倡并强调了多重RT-RPA-PfAgo检测准确区分田间样品中发现的各种病毒物种的能力，强调了其在植物病毒诊断中的潜在应用。
前三行显示RT-PCR检测结果，而热图显示了从RT-RPA-PfAgo方法获得的荧光结果。S1–S22 表示每个字段样本。阳性对照表示为“PC”，无模板对照表示为“NTC”。