Sapphire激光扫描成像系统在HeLa细胞的STAT3/pSTAT3测定中的应用
2024-05-16 来源:本站 点击次数:1145
随着生命科学研究的深入发展，精准、高通量且通用的技术方法在细胞反应及生物过程研究中的需求愈加强烈。传统的Western blot需要细胞裂解和破坏细胞环境，而活细胞成像通常缺乏免疫检测的分子特异性。In-Cell Western（ICW）结合免疫荧光染色和Western blot技术优势，可直接定量评估细胞内和周围细胞环境中的蛋白质表达和修饰，保留关键的生理背景。
为确保ICW实验数据的可靠性，全细胞染色和高级成像至关重要。全细胞染色为数据准确性和归一化奠定了基础，确保反映单个细胞的真实变化，而非细胞密度的差异。
为捕捉微妙、动态的细胞反应及细微差别，高性能、高分辨的激光扫描成像系统不可或缺。Sapphire FL激光扫描成像系统专为卓越生物成像而生。多重荧光检测显著提高实验效率，成像通道间无信号串扰，保障数据的可靠性。结合高质量、经验证的试剂，能有效区分特定信号，甚至可捕获蛋白质表达中最细微的变化。
材料与方法
· 细胞培养
将HeLa细胞连续稀释后，以115μL /孔的体积接种于96孔无菌细胞培养板中。培养皿孵育过夜，随后用IFN-α处理4-12列的细胞15分钟。PBS清洗后，方可进行ICW实验。
· In-Cell Western
100%甲醇-20°C固定细胞20分钟后，使用AzureCyto™渗透液孵育5分钟。随后用AzureCyto封闭液室温振荡封闭1小时。根据表1对细胞进行STAT3和/或pSTAT3检测。将一抗与AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C过夜，进行全细胞染色。PBS洗涤后，将AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室温孵育30分钟。PBS冲洗后可进行成像。
表1.孔板列的处理及检测参照表
· 多通道荧光成像
使用Sapphire FL 532nm、685nm和784nm标准光学模块进行成像，分辨率为10µm，焦距设置为+3.00mm。
· 蛋白归一化
为解释孔间的细胞数量及蛋白含量差异，将每孔的目的蛋白信号归一化为该孔的全细胞染色信号值。找出稀释系列中强度最高的全细胞信号值，将其他每孔的信号值除以该最大值，得出每孔的归一化因子。再将每孔的目的蛋白信号除以相应的归一化因子，得到归一化信号值。
实验结果
pSTAT3在IFN-α作用下表达量增加，有力地证明了结合全细胞染色归一化，ICW可有效捕获强剂量和治疗反应。考虑到孔间的细胞体积差异，全细胞归一化有助于确保数据的可靠性和准确性。值得注意的是，在此ICW实验中，每个扫描通道间信号无串扰，增强了数据的可靠性和完整性。
结果与讨论
ICW是深入了解细胞信号和蛋白质动力学的有力工具，在高通量药物和治疗筛选方面具有广泛而重要的应用。结合Sapphire FL此类高灵敏、高性能的先进成像系统，ICW成为一种强大的通用型工具，可捕捉蛋白表达及细胞反应的动态、微妙变化。
Sapphire FL具有5-1000μm可调节分辨率，飞克级检测灵敏度，呈献高质量数据。其兼容多种样本，除了凝胶、印迹或载玻片等平面样本，还支持孔板、培养皿和小型模式生物等厚样本类型。
除多重荧光成像外，Sapphire FL激光扫描成像系统还可灵活实现近红外荧光、磷屏、化学发光及可见光等多功能成像应用，赋能实验室多样化、更深入的科研需求！
关注我们，解锁更多生物成像新技能，放飞科研无限想象！
咨询热线：400-750-7890
Azure Biosystems关于我们
Azure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域30余年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。
公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，已发表大量文章，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。
为确保ICW实验数据的可靠性，全细胞染色和高级成像至关重要。全细胞染色为数据准确性和归一化奠定了基础，确保反映单个细胞的真实变化，而非细胞密度的差异。
为捕捉微妙、动态的细胞反应及细微差别，高性能、高分辨的激光扫描成像系统不可或缺。Sapphire FL激光扫描成像系统专为卓越生物成像而生。多重荧光检测显著提高实验效率，成像通道间无信号串扰，保障数据的可靠性。结合高质量、经验证的试剂，能有效区分特定信号，甚至可捕获蛋白质表达中最细微的变化。
— 案例：HeLa细胞的STAT3/pSTAT3测定 —
材料与方法
· 细胞培养
将HeLa细胞连续稀释后，以115μL /孔的体积接种于96孔无菌细胞培养板中。培养皿孵育过夜，随后用IFN-α处理4-12列的细胞15分钟。PBS清洗后，方可进行ICW实验。
· In-Cell Western
100%甲醇-20°C固定细胞20分钟后，使用AzureCyto™渗透液孵育5分钟。随后用AzureCyto封闭液室温振荡封闭1小时。根据表1对细胞进行STAT3和/或pSTAT3检测。将一抗与AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C过夜，进行全细胞染色。PBS洗涤后，将AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室温孵育30分钟。PBS冲洗后可进行成像。
表1.孔板列的处理及检测参照表
· 多通道荧光成像
使用Sapphire FL 532nm、685nm和784nm标准光学模块进行成像，分辨率为10µm，焦距设置为+3.00mm。
· 蛋白归一化
为解释孔间的细胞数量及蛋白含量差异，将每孔的目的蛋白信号归一化为该孔的全细胞染色信号值。找出稀释系列中强度最高的全细胞信号值，将其他每孔的信号值除以该最大值，得出每孔的归一化因子。再将每孔的目的蛋白信号除以相应的归一化因子，得到归一化信号值。
实验结果
pSTAT3在IFN-α作用下表达量增加，有力地证明了结合全细胞染色归一化，ICW可有效捕获强剂量和治疗反应。考虑到孔间的细胞体积差异，全细胞归一化有助于确保数据的可靠性和准确性。值得注意的是，在此ICW实验中，每个扫描通道间信号无串扰，增强了数据的可靠性和完整性。
结果与讨论
ICW是深入了解细胞信号和蛋白质动力学的有力工具，在高通量药物和治疗筛选方面具有广泛而重要的应用。结合Sapphire FL此类高灵敏、高性能的先进成像系统，ICW成为一种强大的通用型工具，可捕捉蛋白表达及细胞反应的动态、微妙变化。
Sapphire FL具有5-1000μm可调节分辨率，飞克级检测灵敏度，呈献高质量数据。其兼容多种样本，除了凝胶、印迹或载玻片等平面样本，还支持孔板、培养皿和小型模式生物等厚样本类型。
除多重荧光成像外，Sapphire FL激光扫描成像系统还可灵活实现近红外荧光、磷屏、化学发光及可见光等多功能成像应用，赋能实验室多样化、更深入的科研需求！
关注我们，解锁更多生物成像新技能，放飞科研无限想象！
咨询热线：400-750-7890
Azure Biosystems关于我们
Azure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域30余年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。
公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，已发表大量文章，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。
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