前言

为了模拟肿瘤及其微环境的复杂三维结构特征，三维肿瘤细胞球状体模型已成为不可或缺的体外研究模型系统。本方案详细阐述了利用 µ-Slide I Luer 3D 通道载玻片（87176，ibidi），在胶原蛋白 I 基质中共培养肿瘤细胞球状体与内皮细胞（人脐静脉内皮细胞，即 HUVECs）的实验方法。此外，该模型支持通过灌流培养技术来模拟体内生理条件，为深入研究肿瘤血管生成机制及转移过程提供了有力工具。

图 1：灌流共培养示意图。
 

请注意！本实验方案针对 MCF 肿瘤细胞球状体以及 HUVEC 细胞进行了优化；当使用其他细胞球状体或内皮细胞进行实验时，请对试剂和缓冲液进行适当调整。

• 人脐静脉内皮细胞（HUVEC，12203，Promocell）

• MCF-7 肿瘤细胞球状体（CLS订单号：Cryovial 300273，330273）

• 皮细胞生长培养基（ECGM，Promocell，C-22010）

• 内皮细胞生长培养基 2（ECGM 2，Promocell，C-22011）

• 磷酸盐缓冲液（14190144，Gibco）

• Accutase 细胞解离液（A1110501，Gibco）

• 大鼠尾源胶原蛋白 I，非胃蛋白酶处理，母液浓度 5 mg/mL（ibidi，50201），用 17.5 mM 乙酸溶液稀释至 4 mg/mL；

• 10× RPMI 1640 培养基（Sigma，R1145）

• 1× RPMI 1640 培养基（Sigma，R8758）

• 培养基补充剂（如L-谷氨酰胺，根据细胞类型而定）

• 1 M 氢氧化钠溶液（溶于超纯水）

• 7.5% 碳酸氢钠溶液（Sigma，S8761）

• 无菌超纯水

• µ-Slide I Luer 3D 通道载玻片，经 ibiTreat 表面处理（87176，ibidi）

• ibidi 流体剪切力系统（10902，ibidi），含灰色灌流管套装（10968，ibidi）

• 标准细胞培养设备（超净工作台、细胞解离试剂盒、培养瓶、移液器、吸头、培养皿等）

• 倒置显微镜

• 冰块与冷却架

请注意！为避免气泡产生，灌流管套装与培养基的脱气处理至关重要。请在实验前一天将灌流管套装（不开封）以及细胞培养基（置于一小瓶中，并略微拧松瓶盖）置于培养箱中进行脱气

—只要包装未开启，上述用品即可保持无菌状态。由于气体在水和塑料材料中的溶解度会随着温度的变化而有所差异，因此这一步骤显得尤为重要。具体而言，在高温条件下，水和塑料 对气体的吸收能力会减弱，相较于低温条件下其吸收量会有所减少。

实验者须在无菌条件下执行以下步骤。

图 2：实验流程示意图。
 

此共培养实验的后续步骤需要先前生成的细胞球状体——如需了解生成细胞球状体的详细步骤，请参阅以 下应用指南：

请点击：细胞球状体形成简单的实验方案

• 根据通道载玻片说明书中提供的相关指引，取出先前生成的球状体，并在室温层流罩下将细胞球状体收集到一个试管中。

• 若需在基质胶中添加补充剂，则需将补充剂加入 1×细胞培养基中，并将其置于层流罩内的冰块上。

• 将所有余下成分以及一个足够容纳全部基质胶的无菌试管一同置于层流罩内的冰上。

• 按照本文表 1 中列出的顺序，将除胶原蛋白和细胞悬液以外的所有成分用移液器移入试管中（试管始终置于冰块上），轻柔吹打混匀，然后重新放回至冰上。

移液凝胶时的注意事项：

α）务必使用预冷到 4 ℃ 的移液器吸头对凝胶进行移液！

β）在制备层粘连蛋白-胶原蛋白 I 凝胶时，鉴于其高粘度特性，建议对包含层粘连蛋白与胶原蛋白 I 的所有操作步骤实施反向移液。其具体操作为：先将移液器按压至预设的第二压力点，使凝胶完全填充移液器吸头；待分配凝胶时，仅达到第一压力点即行释放，此举可确保移液管吸头内残留的凝胶被排除，同时确保分配体积的精确度。另外，为优化操作，可选用专为高粘度溶液设计的移液器，如 Eppendorf Visco 系列吸头或 Gilson Microman E 型移液器，以提高工作效率。

γ）请特别注意，即便在 4°C 条件下，凝胶混合物在发生初步凝胶化前的可操作时间也仅限于大约 5 min，因此需严格控制操作时间以保证实验效果。

• 查阅产品分析证书 (CoA)，了解特定批次产品的胶原蛋白浓度，随后用 0.1 M 乙酸将大鼠尾源胶原蛋白 I 稀释至 4.0 mg/mL，稀释时需用移液器吹打混匀，其它详情请参阅以下应用指南：

请注意！在稀释胶原蛋白 I 之前，实验者须将其反复吹打混匀，以形成均一溶液。

• 将胶原蛋白 I 加入至步骤 1- 中所制备的混合液中，在始终保持试管置于冰上的同时，将混合物上下吹打混匀；

• 将 MCF 肿瘤细胞球状体悬液加入至上述混合液中（实验者应在 50 μL 移液体积中移取尽可能多的细胞球状体），随后短暂涡旋以混合样品；

• 至此，混合液已制备完毕，实验者可将其移入 µ-Slide I Luer 3D 通道载玻片中；在移液过程中，载玻片须始终置于冰上；

• 请注意！为避免载玻片底部被冰块划伤，请先将载玻片置于一培养皿中，再将该培养皿置于冰上。

• 撕去附于载玻片上表面的保护箔，并在每个孔中加入16 µL 含有细胞球状体的胶原蛋白 I 基质胶，操作时须避免产生气泡；

• 将盖玻片置于载玻片的粘性区域上，按压盖玻片以确保粘性区域妥善密封；

• 用随附的盖子覆盖 Luer 接头以保持其无菌状态，并将载有基质胶的载玻片置于 37°C、5% CO2CO_2 培养箱中凝胶化 45 min；

• 凝胶化完毕后，用相差显微镜 10× 物镜镜检胶原蛋白纤维。

表 1：使用大鼠尾源胶原蛋白 I 与 RPMI 1640 培养基制备基质胶的加样方案，所有成分均按加样顺序列
 

实验者须在无菌条件下执行以下步骤。

• 如本文「设备与耗材」一节所述，若需使用 ibidi 流体剪切力系统进行灌流培养，实验者需提前一天将灌流管套装和内皮细胞生长培养基（ECGM 以及 ECGM 2 培养基）放入 37°C 培养箱中预热；

• 使用 Accutase 细胞解离液解离 HUVEC 细胞 1~2 min；

• 收集细胞悬液，1000 rpm 离心 4 min，随后用少量 ECGM 培养基重悬，以便计数；

• 对细胞进行计数，用适量 ECGM  培养基调整细胞密度至1.5×106cells/mL

• 用生物相容性 1 mL 注射器将约 250 μL 上述细胞悬液加入至载玻片通道中；

• 用标准吸头从 Luer 接头处吸去剩余细胞悬液，用随附的盖子覆盖 Luer 接头以保持其无菌状态；

• 将载玻片连同一片无菌湿纸巾置于一培养皿中，随后将该培养皿置于 37°C、5%CO2 培养箱中孵育 2 h。

请注意！内皮细胞生长培养基 2 含有如血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子（EGF） 等生长因子，这些生长因子能够诱导细胞的迁移和萌芽生长。

• 孵育 2 h 完毕后，将载玻片与 ibidi 流体剪切力系统相连接，开始进行灌流培养；在灌流培养期间， 请按照使用说明书准备 ibidi 流体剪切力系统，并在储液器中适量 ECGM2 培养基：

• 若需进行延时序列成像，请将载玻片放入显微镜载物台上的培养腔室（如 ibidi 载物台培养箱）中， 并开始延成像（如图 3 所示）；若需进行单帧成像，请提前设置显微镜参数，以尽可能缩短成像时间。不成像时，请将载玻片放回培养箱；若需进行终点分析，请在实验结束时固定细胞，然后继续染 色（详见本文「染色」一节）或执行下游方案。

图 3：灌流培养条件下的延时成像实验装置示意图。
 

5.活细胞相差成像示例

图 4：基质胶上生长的细胞球状体（A）对焦的相差镜检图像与接种 2 h 后的 HUVEC 细胞（B）对焦的相差镜检图像；C）在灌流培养条件下（流速约为 0.5 mL/min）共培养 3 d 后的细胞球状体与 HUVEC 细胞。

6.1.材料

• 磷酸盐缓冲液（14190144，Gibco）

• 即用型 10% 福尔马林溶液（HT5011，Sigma Aldrich）

• Alexa Fluor 488 标记的抗 CD31 抗体（MA5-18135，Invitrogen）

• 鬼笔环肽-iFluor 647 染液（ab176758，Abcam）

• DAPI（D9542，Sigma Aldrich）

• Triton X-100 透化剂（A16046，Thermo Fisher Scientific）

• 破膜缓冲液（0.5% Triton X-100 透化剂，以磷酸盐缓冲液稀释）

• 封闭缓冲液（1% 牛血清白蛋白 + 0.2% Triton X-100 透化剂，以磷酸盐缓冲液稀释）

• 抗体稀释缓冲液（1% 牛血清白蛋白 + 0.05% Triton X-100 透化剂，以磷酸盐缓冲液稀释）

• 牛血清白蛋白（A1470-10G，Sigma Aldrich）

6.2.染色步骤

• 为实验制备足量破膜缓冲液与封闭缓冲液；

• 断开载玻片与流体泵之间的连接；

• 用移液器由 Luer 接头处吸出细胞培养基；

• 用 200 µL 磷酸盐缓冲液轻柔洗涤细胞 2 次，具体方法为：在一侧 Luer 接头中加入磷酸盐缓冲液， 直至观察到液体由另一侧 Luer 接头处溢出；

• 用 10%福尔马林替换磷酸盐缓冲液以固定细胞：首先在 Luer接头处吸去磷酸盐缓冲液，随后在Luer接头中加入 200µL10%福尔马林并令其流过载玻片通道，然后在 Luer接头处吸去此 200μL10%福尔马林，再在 Luer接头中加入另外 200µL10%福尔马林，并孵育细胞 15min；【 】

• 吸去福尔马林，并用 100 µL 磷酸盐缓冲液洗涤细胞 4 次；

• 按照与步骤 类似的方法，用 200 μL 破膜缓冲液替换磷酸盐缓冲液，并孵育细胞 10 min； 吸去破膜缓冲液，用 200 μL 磷酸盐缓冲液洗涤细胞 2 次；

• 按照与步骤 类似的方法，用 200 μL 封闭缓冲液替换磷酸盐缓冲液，并孵育细胞 30 min； 在封闭期间，制备足量抗体稀释缓冲液以稀释一抗和二抗；

• 用抗体稀释缓冲液中将标记的抗体（或一抗）以 1:100 体积比稀释；

• 按照与步骤 类似的方法，用 200 μL 一抗溶液替换封闭缓冲液，并 4°C 孵育细胞过夜；请注意！在以下步骤中，实验者须尽可能地将样品置于暗处，以避免光漂白效应。

• 用 200 µL 封闭缓冲液洗涤细胞 3 次；

• 在相同的抗体稀释缓冲液中，将鬼笔环肽-iFluor 647 染液以 1：1000 体积比稀释，将 DAPI 稀释至

• 10 µg/mL；

• 按照与步骤 类似的方法，用 200 μL 二抗染液替换封闭缓冲液，并避光孵育 2 h； 用 200 µL 封闭缓冲液洗涤细胞 3 次；

• 按照与步骤 类似的方法，每通道用 200 μL 磷酸盐缓冲液替换封闭缓冲液；

• 将载玻片在4°C下避光保存直至镜检——理想情况下，应立即进行成像，因为长时间保存可能会降低 图像质量。

图 5：在灌流共培养 3 d 后，对细胞球状体和 HUVEC 细胞进行染色；细胞核：DAPI（蓝色），肌动蛋白丝：鬼笔环肽-iFluor 647（红色），CD31（HUVEC特异性标记）：Alexa Fluor 488标记的抗CD31抗体（绿色）

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