通过工艺强化，有几种方法可以使抗体生产过程更高效、更便宜。在本研究中，使用超高细胞密度工作细胞库将来自冷冻管的细胞直接接种到生产生物反应器中。在实验室规模实验之后，成功进行了补料分批中试规模实验作为概念验证。此外，细胞以 2L 规模在灌注模式下培养。这里介绍的强化方法可以消除生产生物反应器外的接种物生产，并通过节省时间和空间来创造额外的生产能力。与补料分批模式相比，在灌注模式下，生物反应器生产率可提高 180% 以上。
关键词：中国仓鼠卵巢细胞、补料分批、灌注、1:10 调节比、超高细胞密度冷冻管
 

1  介绍
尽管在最近的新冠疫情期间疫苗的批准和生产激增，单克隆抗体 (mAb) 仍然是最重要的生物制药，仍然占生物制药销售额和新批准生物制药的 50% 以上。这些抗体大多用中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞生产，主要用于治疗炎症和自身免疫性疾病以及癌症 。
由于这对生物制药制造商的重要性，近年来 mAb 生产工艺的改进一直是关注的焦点，目的是降低生产成本并实现更高的生物反应器生产率和制造能力。该工艺强化应用于上游和下游操作。在上游工艺中，强化的重点有三个领域：i. 细胞库，ii. 接种物生产，以及 iii. 抗体生产工艺。建立高细胞密度或大容量细胞库以改进细胞冷冻工艺的方法已被多个研究小组描述。
在这里，通过在冷冻管中冷冻高达 260 × 10⁶ 细胞 mL^–1 的细胞密度 [11] 或在冷冻袋中冷冻高达 150 mL 的体积 ，可以实现每个冷冻单位的大量细胞，这反过来又可以使解冻后摇瓶中的细胞膨胀变得过时。
为了进一步强化种子培养，N-1 灌注是一种选择。在这里，种子培养的最后一步是在灌注模式下进行的，目标是活细胞密度 (VCD) 高达 200 ×10⁶ 细胞 mL^–1，以便随后接种生产生物反应器 [7, 12–15]。强化细胞库和 N-1 灌注相结合用于一步接种物生产已经成功实施 [6,10,15]。
例如，可以通过高接种量补料分批生产来实现 mAb 生产工艺的强化，即在生产生物反应器中接种高起始 VCD，以缩短生产过程并实现更高的产量 。作为补料分批工艺的替代方案，近年来，连续生产工艺的趋势已变得明显。这些灌注工艺的优势在于，可以在数周或数月内以恒定的浓度和质量收获产品，从而简化了下游流程。近年来，一次性领域的新发展使得连续生产工艺在上游和下游领域都变得更容易、更安全。借助现代细胞系、培养基和一次性设备，与补料分批工艺相比，灌注工艺可以实现更高的时空产量。即使在传统上被称为中试规模而非生产规模的生物反应器中，可实现的生产率 > 1gL^–1d^–1，也使得能够同时生产与以补料分批模式运行的立方米规模一次性生物反应器相当数量的抗体。此外，由于占地面积较小，可以同时运行多个较小的生产生物反应器。例如，BiosanaPharma 拥有一种处于临床 III 期的奥马珠单抗生物仿制药，该药以 50L 生物反应器规模生产，计划成为第一个以连续生产工艺生产的抗体 [30]。
在强化 mAb 生产工艺时，还应考虑产品质量。工艺变化会影响质量参数。经常分析的参数是糖基化模式、抗体电荷变体的比例以及碎片和聚集体的比例 [31–35]。其中一些参数是关键质量属性，即它们可能对生物活性、药代动力学、免疫原性或安全性产生重大影响。在功能测定和临床研究中，应逐个抗体研究关键质量属性 。
在之前的研究中，描述了一个 > 250×10⁶ 细胞 mL^–1 的细胞库的建立 [11]。随后，该细胞库被用于在实验室和中试规模中成功实现低种子和高种子补料分批工艺的一步接种物生产 [15]。本研究旨在通过消除生产生物反应器之前的所有种子培养步骤来进一步强化上游工艺。为此，补料分批实验以及灌注生物反应器直接接种来自超高细胞密度工作细胞库 (UHCD-WCB) 冷冻管的细胞（图 1）。在中试规模中，使用 HyPerforma DynaDrive S.U.B. 生物反应器 (Thermo Scientific) 的高调节比，在 50L 生物反应器中仅接种 5L 工作体积。这种方法可以大大简化生产过程，因为接种物生产不再需要基础设施和生物反应器，并且可以将手动操作减少到限度。
 
2 材料和方法
2.1 细胞系和培养基
在所有培养中，均使用产生免疫球蛋白 G (IgG) 的 ExpiCHO-S 细胞系 (Gibco)。对于补料分批培养，使用 Efficient-Pro 培养基 (Gibco) 作为基础培养基，使用 Efficient-Pro Feed 2 (Gibco) 作为补料溶液。基础培养基中添加了 6mmolL^–1 L-谷氨酰胺 (Sigma-Aldrich) 和 0.1% 抗凝剂 (Gibco)。灌注培养使用添加了 4mmolL^–1 L-谷氨酰胺和 0.1% 抗凝剂的高强度灌注 CHO 培养基 (Gibco)。培养开始时使用 0.66x 浓缩培养基，灌注时使用 1x 浓缩培养基。
图 1. 使用 UHCD-WCB 进行的实验的示意图。
 
 
2.2 接种物生产
根据 Muller 等人描述的步骤，在摇瓶（Corning）中在 7 天内进行标准接种物生产。在没有种子培养的实验中，将来自 UHCD-WCB 的冷冻保存细胞（VCD 为 260 ×10⁶ 细胞 mL^–1）解冻，然后直接转移到培养系统中（50L 培养，使用装有预热培养基的转移瓶）或在摇瓶中以 1:10 的比例稀释，并加入预热培养基（摇瓶和实验室规模的生物反应器）。测定 VCD 后，将必要量的细胞悬浮液转移到相应的培养系统中。
 
2.3补料分批模式下的 IgG 生产
在三种不同的培养系统中进行了补料分批模式的 IgG 生产实验：(i) 250mL 一次性摇瓶（康宁），最大工作体积为 54mL；(ii) Ambr 250 模块化容器（哺乳动物版，两个 3 叶片段搅拌器，Sartorius），最大工作体积为 250mL；(iii) 50L HyPerforma DynaDrive S.U.B.（赛多利斯），带有梯形搅拌器组件，该组件带有三个 2 斜叶片搅拌器和一个 2 叶片扫掠搅拌器，最大工作体积为 50L（图 1）。
在第一阶段，对标准接种物生产的补料分批培养（摇瓶）与直接接种 UHCDWCB 的冷冻保存细胞（摇瓶和 Ambr 250）进行了比较。对于这些补料分批实验，接种细胞密度为 0.2–0.3 × 10⁶ 细胞 mL^–1。在标准接种物生产实验的初始批次阶段 3 天后，以及将冷冻保存的细胞直接转移到培养系统 4 天后，开始每日补料程序。取样后，每天以当前工作体积 2vol% 的剂量添加补料培养基，总共 12 天。为了将培养系统中的葡萄糖浓度保持在 2gL^–1 以上，在需要时添加 450gL–1 葡萄糖溶液。
在第二阶段，将强化补料分批培养程序（不进行标准接种物生产）转移到 50L 中试规模。在这里，解冻一个 4.5mL 的 UHCD-WCB 冷冻管，并将细胞转移到起始体积为 5L 的 DynaDrive 生物反应器中。根据细胞的生长情况，在第 2 天到第 6 天之间，使用基础培养基将工作体积线性增加至 38L，以达到补料分批工艺的起始体积。作为实验室规模的缩小比较，同时启动一个 Ambr 容器，接种相同的接种物，每天进行相同的稀释以模拟体积膨胀，这意味着 Ambr 以 100mL 的最小工作体积启动，并且在稀释的第一天必须从生物反应器中取出部分细胞悬浮液，以达到与 DynaDrive 相同的稀释率。从第 7 天开始，在 12 天内每天以 2vol% 的工作体积进行推注喂养。
摇瓶在 37℃、8% CO2、80% 相对湿度和 150min-1 摇动速度（摇动幅度 50mm）的摇动培养箱中培养。 Ambr 和 DynaDrive 中的培养采用恒定比功率输入 40Wm–3、37℃、0.1vvm 覆盖通气、pH ≤ 7.2 和溶解氧 (DO) ≥ 40% 进行。pH 和 DO 设定点通过通入 CO2 或 O2 进行控制。两个系统均自动添加 1:10 稀释的消泡剂 C (Sigma-Aldrich) 溶液。DynaDrive 生物反应器由 G3Pro 控制器 (Thermo Scientific) 控制。
 
2.4 灌注模式下的 IgG 生产
灌注模式培养在配备两个 3 叶段式搅拌器的 3L HyPerforma 玻璃生物反应器（Thermo Scientific）中进行。使用 G3Lab 控制器（Thermo Scientific）作为控制单元。培养在 37℃、0.1vvm 覆盖通气和 165Wm–3 的恒定比功率输入下进行。通过喷射器添加 CO2 或 O2 来控制 pH ≤ 7.2 和 DO ≥ 40%。生物反应器接种来自一个 4.5mL UHCD-WCB 冷冻管的细胞。灌注模式在培养的第 2 天开始。根据细胞密度，每天调整一次灌注率，以保持细胞比灌注率高于 55pLcell^–1d^–1，直到达到 1.0d^–1 的灌注率。在 23 天内保持恒定。随后，将接下来 12 天的灌注率增加到 1.5d^–1，将最后 18 天的灌注率增加到 2.0d^–1。为了将生物反应器的体积保持在 2L 不变，收获泵由生物反应器的重量控制。细胞保留由 suATF2（Repligen）和 XCell Lab 控制器（Repligen）实现。平均流速为 0.9Lmin^–1。为了将活细胞体积 (VCV) 保持在不同的设定点不变，用电容探头（Incyte Arc、Hamilton Bonaduz）控制排气泵。为了将葡萄糖浓度保持在 2gL^–1，添加了 450gL^–1 葡萄糖溶液。为此，使用了 CITSens MeMo 葡萄糖探头（梅特勒-托利多有限公司，C-CIT 传感器）。
 
2.5 分析
每天一次对补料分批和灌注实验进行取样，并使用 Cedex HiRes 分析仪（Roche Diagnostics）分析细胞特异性参数 VCD、总细胞密度、活力和细胞直径。使用 Cedex Bio 分析仪（Roche Diagnostics）测定底物葡萄糖和谷氨酰胺以及代谢物乳酸和铵以及产物 IgG 的浓度。
根据 N-糖基化、电荷变体以及抗体的低分子和高分子种类的比例分析抗体质量。使用 Protein A 树脂纯化后，使用亲水相互作用超高效液相色谱分析聚糖，使用阳离子交换高效液相色谱分析电荷变体，并使用尺寸排阻色谱分析抗体的低分子和高分子种类

3 结果与讨论
3.1 实验室规模的补料分批实验
在摇瓶中分别进行了三次补料分批实验，采用标准接种生产，并直接从摇瓶和 Ambr 生物反应器中的冷冻管中接种。强化工艺中的接种细胞密度为 0.20 ± 0.02×10⁶ 细胞 mL^–1 (SF_int) 和 0.21 ± 0.01 ×10⁶ 细胞 mL^–1 (AM_int)，而参考摇瓶中的接种细胞密度为 0.28 ± 0.03 × 10⁶ 细胞 mL^–1 (SF_sta，图 2a)。正如我们之前的研究 [11,15] 中所见，强化过程中第一天的生长率比参考实验（SF_sta，0.038 ± 0.005h^–1）低 45%，而 AM_int 为 0.017 ± 0.003h^–1，SF_int 为 0.017 ± 0.005h^–1，指数期偏移了大约一天。因此，饲料从第 4 天开始，而不是第 3 天。我们之前的实验和其他团队已经描述了滞后阶段和培养开始时活力的轻微下降 [4, 8, 10, 11, 15]。
参考实验中的最大 VCD 为 18.5 ± 0.9 × 106 细胞 mL–1，在第 6 天达到，在一天后的强化过程中，VCD 为 16.8 ± 1.1 × 10⁶ 细胞 mL^–1（SF_int）和 13.9 ± 0.4 × 10⁶ 细胞 mL^–1（AM_int）。在所有实验中，细胞活力一直保持在 90% 以上，直到培养结束（图 2a）。最大 VCD 不同的原因可能是细胞在添加四到五次饲料后进入稳定期。如果此时 VCD 较低，则不会进一步增加。因此，较低的最大 VCD 值可以归因于之前的生长。由于第一次喂食时 VCD 较低（SF_int 为 3.4 ± 0.4 × 10⁶ 细胞 mL^–1，AM_int 为 3.2 ± 0.3×10⁶ 细胞 mL–1，而 SF_sta 为 4.4±0.5 × 10⁶ 细胞 mL^–1），且 ambr 实验中的生长率在第 6 天和第 7 天之间保持较低（0.014 ± 0.002h^–1，而 SF_int 为 0.019 ± 0.003h^–1），因此最大 VCD 保持较低。
尽管如此，IgG 产生的过程是可比的。根据生长的时间变化，IgG 的产生也偏移了一天（图 2b）。收获时，可达到相当的最大 IgG 滴度 3.71 ± 0.14gL–1 (SF_sta)、3.57 ± 0.07gL–1 (SF_int) 和 3.65 ± 0.03gL–1 (AM_int)。这些滴度与先前研究中描述的滴度相似 [15]。细胞直径、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵的曲线没有显示相关偏差，可在支持信息 (SI；图 S1) 中找到。结果表明，UHCD-WCB 可以消除实验室规模补料分批工艺对接种物生产的需要。
根据各种属性分析了抗体质量。N-糖基化中 G0F 聚糖的比例在 82 ± 1% (SF_int 和 AM_int) 和 84 ± 2% (SF_sta) 之间，第二高的比例是 G1F (SI 图 S4a)。这种糖基化模式很有前景，因为人类 IgG 在体内主要以 G0F、G1F 和 G2F 的形式存在 [34]。所有实验中的电荷变体也相似，主峰约为 40%，酸性和碱性变体各约为 30%（SI 图 S4b）。碎片和聚集体的比例很低，单体比例在 93 ± 1%（SF_sta）和 94 ± 1%（SF_int 和 AM_int）之间（SI 图 S4c）。这些结果表明，使用 UHCD-WCB 对抗体质量参数没有影响
图 2. 在摇瓶 (SF) 和 Ambr (AM) 中以标准 (sta) 和强化 (int) 接种物生产进行补料分批培养期间，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) IgG 浓度的时间过程。所有实验的 N = 3。
 
3.2概念验证中试规模补料分批生产
然而，对行业来说更有趣的当然是 UHCD-WCB 在更大规模上开辟的可能性。由于 DynaDrive 的生物反应器概念使得仅使用 5L 的起始体积即可工作，因此 50L 生物反应器以 0.18 × 10⁶ 细胞 mL^–1 开始，仅使用一个 4.5mL 的冷冻管进行接种（见第 2.3 节）。由于第 2 天和第 6 天之间的连续稀释（图 3b），VCD 在第 4 天之前保持在 1.0 × 10⁶ 细胞 mL–1 以下，在第 6 天之前保持在 3.0 × 106 细胞 mL–1 以下，无论是在 DynaDrive 中还是在平行 Ambr 中（图 3a）。在第一天的滞后期之后直到第 7 天第一次补料，生物反应器中的扩增生长呈指数增长。在第 11 天达到最大 VCD 17.0 × 106 细胞 mL–1（Ambr：14.7×10⁶ 细胞 mL–1）之后，DynaDrive 中的细胞存活率在培养结束时缓慢下降至 85%，而在 Ambr 中，收获时细胞存活率仍超过 95%（图 3a）。尽管如此，在整个补料分批阶段，DynaDrive 中的 VCD 仍然高于 Ambr。存活率较低很可能是因为在 Ambr 中，一些死细胞被泡沫从悬浮液中漂浮出来并粘附在生物反应器壁和其他生物反应器元件上，由于工作体积几乎恒定，它们一直留在那里（图 3b）。另一方面，在 DynaDrive 中，粘附在生物反应器壁上的细胞会随着反应器体积的增加而再次悬浮，因此在取样过程中也会被检测到。与其他实验相比，这两个生物反应器在第 8 天之后的生长减缓是不典型的，并导致最大 VCD 相对较低。
在补料阶段（从第 7 天到第 19 天），两个系统的每日特异性 IgG 生成率 qIgG 相当（图 4b），22.2 ± 5.2 pg 细胞/天（DynaDrive）和 22.0 ± 6.2pg 细胞/天（Ambr），并且达到了相似的 IgG 浓度。经过 19 天的实验，在 DynaDrive 中收获了 3.58gL-1 IgG，在 Ambr 中收获了 3.49gL-1（图 4a），与第 3.1 节中的标准补料分批的结果和之前的结果相当 [15]。细胞直径、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵的曲线没有显示相关偏差，可以在支持信息中找到（图 S2）。两个补料分批工艺结束时的抗体质量在所有属性上与第 3.1 节中的实验相当，并且无法确定调整工艺的影响（SI 图 S4）。这些结果表明，综合起来，UHCD-WCB 和高调节比的生物反应器可以消除所有小于 50L 的生物反应器，从而节省空间、时间和劳动力。
 
3.3 概念验证 2 L 灌注
在补料分批生产实验中，用 UHCD-WCB 冷冻管中的细胞接种显示出良好的结果，然而 mAb 生产的趋势越来越倾向于灌注。因此，2L 生物反应器接种了一个冷冻管中的细胞，并在灌注模式下使用 suATF2 进行操作。在 57 天的培养期内测试了四种不同的 VCV 和灌注率设置，以确定 VCV 特异性抗体生产率和体积生产率最高且细胞活力不会下降太快的 VCV 特异性灌注率范围（表 1、图 5a）。
图 3. 在补料分批培养过程中，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) 生物反应器体积的时间过程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的强化 (int) 接种物生产作为缩小参考 (ref)。两个实验的 N = 1。
 
 
图 4. 在补料分批培养过程中，a) IgG 浓度和 b) 特定 IgG 生成率 qIgG 的时间过程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的强化 (int) 接种物生产作为缩小参考 (ref)。所有实验的 N = 1。
 
在第一阶段提供 31 μL mm–3d–1的 VCV 特定灌注率并在最后阶段提供 41 μL mm^–3d^–1 时，细胞存活率高于 97%，但在第二和第三阶段，存活率依次下降，分别为 22 和 24 μL mm^–3d^–1，在第 40 天降至 87%（图 5b）。
随着存活率的下降，细胞生长也随之下降，因此出血率也随之下降，反之亦然（图 6）。在两个高存活率阶段，出血率约为 0.50d^–1，在第 21 至 27 天之间仅为 0.21 ± 0.07d^–1，在第 29 至 38 天之间甚至仅为 0.15 ± 0.06d^–1。为了尽可能减少因失血而造成的产品损失，我们的目标是尽可能降低细胞生长速度 [38]。但与此同时，细胞存活率也不能下降太多，因为这可能会降低 mAb 质量，增加细胞碎片和蛋白质的积累，而这些碎片和蛋白质在一定程度上会被 ATF 截留。本研究关于失血率和存活率变化的结果表明，该细胞系和培养基的最佳 VCV 特异性灌注率为 25 至 30μL/mm^–3d^–1
 
表 1. 灌注率、目标 VCV 和达到的 VCV。

栽培时间	灌注率 [d–1]	目标 VCV [mm3mL–1]	已实现 VCV [mm3mL–1]	VCV特定灌注率  [μL mm3d–1]
Day 6 – day 18	1.0	30	32 ± 2	31
Day 21 – day 27	1.0	45	45 ± 2	22
Day 29 – day 40	1.5	60	63 ± 4	24
Day 50 – day 57	2.0	50	49 ± 2	41

 
这些结果也得到了产品形成的支持。在第 21 至 27 天之间的阶段，生物反应器和收获物中的 IgG 浓度达到最高（图 7a）。随后 VCV 设定点和灌注率的增加再次导致 IgG 浓度降低，但体积生产率（根据 ATF 下游收获的 IgG 量相对于生物反应器体积计算）从 0.50 ± 0.07gL^–1d^–1（d21-d27）增加到 0.73 ± 0.05gL-1d-1（d29-d40）（图 7b）。相比之下，在存活率和生长率较高的阶段，只能收获 0.19 ± 0.04gL^–1d-^–1（d6-d18）和 0.29 ± 0.07gL^–1d^–1（d50-d57）。这不仅是因为出血率较高，还因为此阶段细胞的 IgG 产物形成率 qIgG 较低（图 7b）。体积生产率是灌注过程的关键参数。现代工艺在 1.0^–1.3d^–1 的灌注率下可实现约 1gL^–1d^–1 的生产率[22,23]。然而，这些过程中使用的是 CHO K1 细胞，在如此低的灌注率下，其 VCV 可以生长到 100mm3mL-1 以上，因此，与本研究中的 VCV 特定生产率相当，足以实现比本研究中使用的 CHO-S 细胞高得多的生产率。
细胞直径、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵的进程可以在支持信息中找到（图 S3）。在四个目标稳态（第 15 天、第 25 天、第 35 天和第 55 天）中的每一天分析抗体质量。尽管与补料分批实验相比，糖基化模式和批次变体的分布有所不同，但在灌注实验期间，所有质量属性均保持不变，表明产品质量恒定，尽管在过程中设置了不同的参数（SI 图 S5）。
图 5. 2L 灌注培养期间 a) 灌注率和 VCD，以及 b) 灌注率和活力的时间过程（N = 1）。
 
图 6. 2L 灌注培养过程中灌注率和失血率的时间过程（N = 1）。
 
 
4 Conclusions 结论
在之前的研究中，研究了已建立的 UHCD-WCB 在批量模式下的生长和生产行为 [11]，并实现了一步接种生产 [15]，本研究的结果表明，以及如何消除生产生物反应器外的接种生产。在实验室规模的补料分批实验中，直接从 UHCD-WCB 冷冻管接种的工艺与标准工艺仅在一天的滞后阶段有所不同。随后，生长和生产都具有可比性（第 3.1 节）。
对于工业生产过程，中试规模的良好结果更令人感兴趣（第 3.2 节）。仅用一个冻存管就成功接种了 5L 工作体积的 DynaDrive，一方面表明使用 UHCD-WCB 并直接在生产生物反应器中扩增细胞可以取代 10 天的标准接种物生产，仅需额外 4 天的扩增时间，节省 60% 的时间；另一方面，揭示了立方米规模的补料分批工艺的两种可能性：(i) 50L 生物反应器可用一个小瓶接种，可在批量或灌注模式下作为 N-1 步骤操作，可用作一次性生产规模的低种子或高种子补料分批培养的接种物，甚至可以在不锈钢生物反应器中达到两位数的立方米规模；(ii) 通过在 UHCD 范围内的 150mL 冷冻袋中冷冻 WCB，可以成功接种起始体积为 250L 的 5m3 DynaDrive 生物反应器。
此外，UHCD-WCB 还用于概念验证灌注实验（第 3.3 节）。所得结果表明，优化工艺可使生产率达到约 0.7gL-1d-1 IgG（基于生物反应器体积），持续数周或数月。因此，除去工艺开始时的非生产性生长阶段，在灌注模式下，在 15 天内可收获 10.5gL-1 IgG，而补料分批模式下则可收获约 3.7gL-1 IgG，多出 180%。灌注结果可转移到中试和生产规模，类似于补料分批结果。由于 CHO K1 细胞在灌注过程中比本研究中使用的 CHO-S 细胞具有更高的生产率，因此在 UHCD 范围内冷冻产生 mAb 的 CHO K1 细胞系并使用 DynaDrive 生物反应器可以实现 50 L 规模的高产生产过程，其中不需要外部种子培养
 
图 7. a) 生物反应器和收获物中的 IgG 浓度和 IgG 保留率的时间过程，以及 b) 2L 灌注培养 (N = 1) 期间生产率和细胞体积特定 IgG 生产率 qIgG。