细胞名称： HuH-7(人肝癌细胞)
细胞别称： HuH-7；HUH-7；HuH7；Huh7；HUH7；JTC-39；JapaneseTissueCulture-39
细胞货号： SNL-085
生长特性： 贴壁
培养条件： DMEM+10% FBS+1% P/S
培养环境： 37℃；5% CO2；饱和湿度
细胞简介： HuH-7细胞来自患有肝癌的57岁日本男性肝脏，据报道可产甲胎蛋白、胰酶α抗体、血浆铜蓝蛋白、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白等。
HuH-7细胞培养注意事项
 

• 细胞有触角/伪足

HuH-7细胞有多个触角/伪足，属于细胞自身特性，为正常现象。  

• 培养时存在黑点

HuH-7细胞中有黑色颗粒，为细胞器、细胞内囊泡或其他胞内物质，属于细胞自身特性。背景中也有少量黑色颗粒，为细胞碎片。少量碎片不影响细胞生长，若碎片较多，可以吸走培养基后用预热的PBS轻轻润洗1-2遍。
 

• 控制接种密度

HuH-7细胞接种密度过低时生长速度缓慢。推荐传代比例1：2-1：3，参考传代周期3-4天。（注意T25培养瓶底面积为25cm2，10cm培养皿底面积是55cm2。一个T25传两个10cm皿约等于1：4传代，而非1：2）。
 

• 控制消化时间

HuH-7消化难度中等，使用0.25%胰酶（含EDTA）放37度培养箱消化，参考消化时间3-4min。因不同实验室使用的胰酶品牌不同，需根据实际情况调整时间。实际操作中，消化到细胞部分自然滑落时再终止消化。变圆但未脱落时需要继续消化，确保细胞是被胰酶消化下来而不是被强行吹下的，避免细胞损伤。
 
HuH-7细胞传代攻略

• 准备所需的培养基、胰酶、PBS、离心管、培养瓶以及无菌枪头等；（试剂提前预热）
• 先尽量吸干净T25瓶原培养基，再加5mL 常温PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS；
• T25瓶加1mL胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层，将培养瓶放入37度培养箱消化；
• 消化到细胞明显回缩，间隙变大，但未完全脱落时加2-3mL完全培养基终止胰酶消化；
• 混匀细胞并转移至离心管中，1000rpm离心3min；
• 在新的培养瓶中加入适量新鲜培养基；（T25推荐10mL，T75推荐20mL）
• 离心完成后，弃上清，加入适量新鲜培养基轻轻重悬吹散细胞，将细胞悬液均匀接种至培养瓶中，十字法或8字法混匀，然后放入培养箱中继续培养，注意培养瓶盖透气；

 
Tips：
l 如果您无法准确掌控胰酶作用时间，建议按照下述操作：加入胰酶后，放入37度培养箱消化，然后每隔1min拿出观察，倾斜培养瓶，若细胞部分滑落，说明可以终止消化，否则再放回培养箱消化1min重复操作。
 
HuH-7细胞冻存攻略

• 配制程序性冻存液，准备相应数量冻存管并做好标记。
• 先将细胞按传代步骤获得细胞沉淀；
• 加入适量程序性冻存液轻轻重悬细胞，并将细胞悬液转移至冻存管中；
• 将冻存管放入程序性冻存盒，放入-80℃冰箱过夜；
• 转移冻存细胞至液氮保存并登记细胞保存位置。

Tips：

• 推荐冻存液配方92% FBS + 8%DMSO或92%完全培养基+8%DMSO

• 液氮保存24h后建议复苏一管检测冻存细胞的活性，若活性合格即可长期保存。
• 程序性冻存液需要配合程序性冻存盒使用，若使用非程序冻存液请按产品说明书处理降温过程。
• T25培养瓶长满通常可冻存1-2管，10cm皿长满通常可冻存2-3管。
• 冻存密度低将导致复苏后细胞状态不佳。
• 没有程序冻存盒的实验室，加入细胞后可以将冻存管放在泡沫盒中（不用泡沫盒细胞复苏活率低）4度静置5-10min，再-20度静置2h后转入-80度过夜，第二天转入液氮保存。

 
HuH-7细胞复苏攻略

• 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温至室温或37℃，离心机设置好转速；
• 将细胞从液氮罐中取出，观察管内无液氮的情况下，捏住管盖，将细胞冻存部分浸入水浴锅迅速摇晃，细胞融化完全融化或米粒大小冰块时终止水浴，融化过程不超过2min；
• 直接将冻存管以离心力150g(约900rpm)左右离心2min，不同离心机具体转速会有差异
• 离心完成后弃上清，用预热的培养基缓慢加入冻存管，轻柔重悬细胞后接种至培养瓶中，轻轻混匀后放入培养箱；
• 复苏24小时后观察细胞贴壁情况。

Tips：

• 若液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。
• 冻存管在液氮长期保存过程中难免渗入液氮，取出细胞时震动不要过大。水浴前一定要观察管内是否存在液氮，若有液氮需静置一会待液氮完全蒸发后再水浴。做好防护，避免冻存管炸开导致受伤。
• 水浴时使用一次性PE手套包住冻存管避免直接接触水源，避免污染。
• 水浴后观察还有较大冰块时要继续水浴直到融化
• 整个细胞复苏过程在尽可能5-10min内完成。

 
HuH-7细胞收货攻略

• 常温细胞

• 收货后，拆开外包装，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培养箱静置2h以上；
• 吸走大部分培养基并留10-12 mL在原瓶，显微镜下拍照保存细胞状态照片，观察细胞密度，若细胞密度大于80%即可按比例传代（首次传代比例建议1：2），若细胞密度低于80%，拧松瓶盖，继续培养至细胞密度80%以上再进行传代培养。
• 发货T25瓶中灌装的是与细胞配套的完全培养基，上一步吸出的培养基（约75mL）转移至50mL离心管1500rpm离心5min，取上清保存于4度冰箱，用于培养细胞，以平稳过渡到客户自己的培养基。

 

• 冻存细胞

• 细胞收货后尽快开箱检查，若干冰充足可以取出细胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天内复苏）短期保存或液氮中长期保存，若干冰完全挥发建议立即复苏细胞并联系销售人员解决；
• 冻存细胞建议尽快复苏一管培养检查，以免超出售后期，复苏步骤参考复苏攻略；
• 复苏一管细胞出现异常及时联系销售人员，在专业技术支持的指导下进行下一步操作；

Tips：

• 细胞收货出现漏液、培养瓶破损、干冰完全挥发等异常情况时，及时拍照联系销售人员；
• 尚恩生物T25瓶发货的细胞内含对应细胞的完全培养基，可以收集原装培养瓶内培养基经1500rpm离心5min后，取上清于4℃保存用于后续细胞培养；

 
常见问题及解决方案
NO.1细胞密度怎么计算的？
严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了精确控制细胞数量而消化细胞计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式；
 
NO.2培养过程中细胞碎片较多怎么处理？
1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。
2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可通过换液去除，因此每2天正常换液即可，换液前培养基充分预热。
 
NO.3细胞具体消化时间是多久？
每个客户用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，不能完全规定消化时间，以实际消化效果和客户经验为准。