在基础实验中，经常会用的实验就是细胞实验，所以细胞培养技术非常重要。实验室用最多的应该是永久性细胞株，涉及的就是细胞培养（细胞传代）、细胞复苏和细胞冻存。在这里，说明永久性细胞株的培养，原代细胞的培养相对难些，要求也更高。

以25cm的细胞培养瓶为例：

1、细胞复苏

（1）预先对超净工作台进行消毒灭菌；同时，开启水浴锅，将温度设定为37 ℃，并将冻存管迅速转移至37 ℃水浴锅中快速摇动，直至冻存液全部融解。(切记要快速转移）
（2）将冻存管中的细胞液转移至灭菌的1.5 mL Ep管中，800~1000 rpm离心5 min。弃上清液，使用含10 %胎牛血清的培养基对细胞进行重悬，将细胞悬液转移至专用的无菌细胞培养瓶，再加入3~4 mL培养基，使用移液枪轻轻吹打均匀。
（3）显微镜下观察，以细胞分散均匀不成团为标准；标记细胞瓶后，放置培养箱中。

注意：有些实验室使用的不是1.5 mL Ep管，有可能是15mL 的离心管，可在离心管中加入8-9 mL的新培养基再离心；如果是用细胞皿，操作也是相同的，根据细胞皿加对应体积的新培养基；还有一些实验室是不离心，直接将冻存液加新培养基培养的，这种方法也可以，建议细胞贴壁后及时更换培养液。

2、细胞传代

（1）当细胞培养瓶内的细胞汇合率大概达到80 %，即可进行传代；弃旧培养液，使用室温的PBS润洗细胞的贴壁生长面2次，每次2 mL，使用移液枪小心吸尽残液；
（2）再加入1 mL的胰酶（0.25%），轻微摇动细胞瓶，确保胰酶能覆盖所有细胞，显微镜下观察到细胞开始皱缩时弃胰酶；再加入2 mL完全培养基并轻轻吹打瓶壁上的细胞，当细胞全部下来后，可再轻缓吹打细胞悬液，直至显微镜下观察到细胞分散成单个细胞。
（3）根据后续的细胞密度与实验需求，弃去多余的细胞液或按比例扩大培养，再加入完全培养基，轻轻吹打均匀后将其置于细胞培养箱内继续培养。

注：有些实验室会根据经验，把加入胰酶的细胞放入培养箱中，可加快胰酶的酶解速度，具体根据细胞的贴壁情况。

3、细胞冻存

（1）当细胞培养瓶内的细胞汇合率大概达到80 %，利用细胞传代的方法，将吹打均匀的细胞悬液转移至离心管中，800~1000 rpm离心5 min；
（2）准备好细胞冻存管，并在冻存管中配好冻存液（胎牛血清：DMSO=4：1）；取1 mL完全培养基将离心的细胞重悬，然后取500uL的细胞重悬液加入冻存管，吹打混匀；
（3）在冻存管上做好标记，如细胞全称、冻存日期等；将冻存管放入细胞冻存盒中，放入-80 ℃冰箱中进行缓慢降温，24 h后即可转移至液氮罐中储存。

注：市面上有配好的冻存液，不差钱的建议直接买现成的。

4、细胞计数

（1）提前用酒精棉球将细胞计数板和盖玻片擦拭干净，并晾干备用；
（2）利用细胞传代的方法，使用新的培养基将细胞吹打成单细胞悬液，并在计数板上滴入细胞悬液（可适当稀释降低细胞密度）；
（3）在光学显微镜下，对细胞进行计数，只计算左上或右下两侧的压线细胞数。然后计算：细胞数/mL=四大格细胞总数 / 4×104(每个大格的体积为0.1 mm3，而1 mL=1000 mm3)；依据实验安排以及得到的细胞数与体积比，对细胞进行适当稀释。