病毒转染，是以病毒载体介导的一种高效的细胞转染技术，其将外源基因包装到病毒的外壳中，利用病毒的天然感染性，从而将外源基因导入宿主细胞当中，使外源基因在细胞中稳定表达。根据病毒载体不同，常见的分为腺病毒（Adenovirus，ADV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、逆转录病毒（Retrovirus，RV）、腺相关病毒（AAV）。目前实验室用的比较多，使用范围广的是慢病毒，接下来，我们就讲讲慢病毒。

一 、慢病毒结构

慢病毒是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，是一种有包膜的RNA病毒，直径为80-120nm，呈二十面体对称球形结构。病毒颗粒最外层是包膜(包膜蛋白决定了感染细胞的类型)，往内依次为基质蛋白和衣壳，最里面是两条相同的正股RNA链和一些酶，包括逆转录酶、整合酶和蛋白酶。

▲慢病毒结构示意图

慢病毒含有复杂的基因组。以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为例，HIV-1是一种单链RNA病毒，共有9个基因。基因组两端各有一个反向末端重复序列(LTR)，中间包括gag、 pol、env 3个编码病毒的结构基因，tat、rev2个调节基因， vif、vpr、vpu、nef 4 个辅助基因。随着对慢病毒基因组的深入研究以及转染技术的发展，人们对慢病毒基因组进行编辑，将其基因分布在不同的质粒中，在安全性和包装能力方面不断改进，从而衍生了第一代、第二代、第三代慢病毒系统。其中第二代三质粒系统和第三代的四质粒系统是目前大家应用比较多，比较广的。以第二代的三质粒系统为例，该系统包含1个包装质粒—编码Gag、Pol、Rev 和Tat 基因, 产生病毒颗粒；一个包膜质粒—Env或VSV-G表达病毒糖蛋白,提供受体结合蛋白；以及一个穿梭质粒—带有外源目的基因。下图是第二代和第三代慢病毒质粒包装系统示意图。

图左：第二代慢病毒包装系统示意图

图右：第三代慢病毒包装系统示意图

详细查看点击下方链接：

https://www.addgene.org/guides/lentivirus/

二、慢病毒复制包装

为了使靶细胞转染效率更高，前期需要获得高滴度的慢病毒，也就是需要进行慢病毒的复制包装。通常情况下，将3质粒按照一定比例添加，共同转染到293T细胞中孵育，48-72小时后，将含有该病毒的上清液离心收集，或进一步浓缩病毒。

▲慢病毒结构示意图

三、慢病毒感染细胞过程

慢病毒感染细胞的第一步是通过其表面的包膜蛋白与宿主细胞吸附并与表面受体结合。与宿主细胞膜融合后，释放病毒内部的结构蛋白、酶蛋白以及病毒核心。在逆转录酶的作用下，慢病毒RNA逆转录并与整合酶形成整合前复合物。随之整合前复合物进入宿主细胞核后，整合酶催化其整合至宿主细胞基因组。最后外源基因前启动子驱动其在宿主细胞质中表达。

▲慢病毒感染宿主细胞示意图

四、常见慢病毒转染类型

1、慢病毒荧光转染
细胞转染一些标记的荧光基团(GFP/mCherry/RFP等)，筛选出来的目的细胞带有荧光蛋白。细胞在吸收荧光激发能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其恢复至基态时，以发射光形式释放出能量，发射出一定波长的光。可以通过倒置荧光显微镜或者流式细胞仪检测其转染后荧光强度来检验转染效率。

2、慢病毒Luciferase化学发光转染

将携带荧光素酶编码基因(Luc)的质粒转染入细胞或者导入研究动物体内后，会产生荧光素酶(一种可以催化荧光素底物产生荧光的酶)。加入荧光素(底物)，在ATP和荧光素酶的作用下，荧光素(底物)能够被氧化发出绿色或黄色荧光。通过高灵敏生物发光成像技术检测检测光强度变化。尤其是检测活体动物体内肿瘤的生长、转移发展过程。

3、慢病毒细胞永生化转染

体外分离培养的原代细胞，通过某种方法如病毒感染、辐射或者化学致癌作用，打破细胞原有的分裂次数限制，使其获得一定分裂生长的能力，延缓细胞衰老死亡。利用慢病毒转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞内，从而获得具有无限增殖能力且细胞间无差异的永生化细胞株。 

我们尚恩生物公司对常用的细胞系，原代细胞进行慢病毒转染，包括细胞慢病毒转染绿色荧光蛋白（ZsGreen）或者红色荧光蛋白（mCherry、RFP）、细胞慢病毒转染化学发光LUC、细胞慢病毒SV40永生化转染，总共近40种稳转细胞系。也可以进行指定细胞的慢病毒转染。

 

左：HEK293-GFP-40X

右：143B-GFP-100X

 

左：HCT116-GFP-40X         

右：HUVEC SV40-GFP-100X

 

左：4T1-GFP-100X   

右：A549-RFP-100X

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