分枝杆菌是一大类细菌,广泛存在于自然环境中。其中一些种类会导致人类患上严重疾病,是传染病感染中的主要死亡原因。临床上结核分枝杆菌(MTB)和牛分枝杆菌(MB)是导致人类结核病(TB)的主要原因;鸟分枝杆菌(MAV)和细胞内分枝杆菌(MI)是导致人类肺部疾病的常见原因。非结核杆菌和人类结核杆菌感染后的症状相识,极易导致误诊。所以需要准确的物种鉴养,辅助制定有效的结核病和非结合杆菌感染的治疗策略。细菌培养仍然是鉴定分支杆菌感染的金标准方法,培养周期漫长,需要约6周左右的时间。因此,需要开发精准快速的鉴定方法至关重要。
发表在Clinica Chimica Acta的一篇文章中通过基于RPA结合CRISPR-Cas12a的等温扩增技术,准确鉴定临床分离株中的8种分枝杆菌菌株;对各种靶向分枝杆菌的检测限为1-100拷贝/反应,特异性和灵敏度高;反应速度快,一个小时内可以获得结果;快速、便携且用户友好,非常适合资源匮乏的临床环境。
工作示意图:步骤包括(1)使用RPA反应扩增部分rpoB基因(2)用Cas12a切割靶DNA,然后反式切割荧光团-淬灭剂ssDNA-报告基因,(3)通过蓝/白光透射仪观察释放的荧光信号,肉眼可见。
材料和方法
(1)细菌菌株和临床样品的制备:提取8个参考菌株DNA 和热灭活分枝杆菌,包括结核分枝杆菌菌株 ATCC27294、牛分枝杆菌菌株 ATCC19210、脓肿分枝杆菌 ATCC19977、鸟分枝杆菌菌株 ATCC700898、偶发分枝杆菌菌株 ATCC6841、堪萨斯分枝杆菌菌株 ATCC12478、戈登分枝杆菌菌株 ATCC14470、细胞内分枝杆菌菌株 ATCC13950 和共 80 个临床分离株。小量制备试剂盒提取和纯化 DNA。
(2)靶向基因引物和gRNA设计:从ATCC和 NCBI 获得来自每个分枝杆菌物种的 rpoB 基因核苷酸序。设计靶向 rpoB 基因的 RPA 引物并进行比对。试剂盒制备gRNA。
(3)重组酶聚合酶扩增 (RPA):使用 TwistAmp Basic 试剂盒(TwistDx,UK)。总体积为 10 μL 、含有 5.9 μL 含冻干反应的再水化缓冲液、0.48 μL 10 μM 正向和反向引物以及 2.14 μL 蒸馏水。然后,加入 1 μL 基因组 DNA 模板和 0.5 μL 280 mM MgOAC,然后在 39 °C 下孵育 30 分钟,然后在 75 °C 下热灭活 5 分钟。蒸馏水用作 NTC(无模板对照)。
(4)CRISPR-Cas12a 检测方法:1.5 μL 500 nM gRNA、0.75 μL 330 nM SrCas12a、1 μL 6 μM 荧光团淬灭基团报告基因(FQ 报告基因)(6FAM-AGGACCCGTATTCCCA-BHQ1)、1.5 μL 10x NEBuffer 2.0 反应缓冲液和 1 μL RPA 产物。用蒸馏水将总体积调节至 15 μL。将反应物在 39 °C 下孵育 15 分钟。使用 BluPAD Dual LED 蓝/白光透射仪 (BIO-HELIX,台湾) 观察荧光信号。使用智能手机相机捕获荧光读数,并使用 ImageJ(NIH,美国)自动调整。对于荧光定量,通过 Applied Biosystems™ QuantStudio™ qPCR Systems(Thermo Fisher Scientific,美国)测量荧光。每个实验重复 3 次。
(5)评估特异性并确定参考菌株的检测限:通过对 7 种分枝杆菌属的交叉反应性测试来评估 gRNA 的特异性。检测限 (LOD) 一式三份,将每个标准 DNA 靶标从 10 个靶标中连续稀释 10 倍5拷贝数/μL 低至 1 拷贝/μL 作为 MyTRACK 检测的模板。通过检测基因组 DNA 浓度最低的试管中的荧光信号来确定 LOD。对各种靶向分枝杆菌的检测限为 1 - 100 拷贝/反应。
尚睿生物简介:
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