实时荧光定量PCR荧光探针与荧光染料技术原理简述
2025-05-14 来源:本站 点击次数:31
实时荧光定量PCR（后续简称为qPCR）顾名思义就是在PCR反应体系中加入荧光物质，通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程，由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此为依据进而达到定量的目的。简单来讲，qPCR可分为荧光染料法（以SYBR GreenⅠ最常用）与荧光探针法（TaqMan 探针）两种，而其结果分析方法也有绝对定量和相对定量之分。
根据所使用的技术不同，实时荧光定量PCR可以分为：荧光探针和荧光染料两种方法。
现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的3'→5'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的shou选技术平台
2. SYBR荧光染料
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加wan全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。SYBR荧光染料法定量PCR的基本过程是：
① 开始反应，当SYBR染料与DNA双链结合时发出荧光；
② DNA变性时，SYBR染料释放出来，荧光急剧减少；
③ 在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR引物；
④ 聚合完成后，SYBR染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
实时荧光定量PCR技术根据化学原理可以分为探针类和非探针类。探针类实时荧光定量 PCR 技术主要是利用与靶序列特异杂 交的探针来指示扩增产物的增加；非探针类实时荧光定量 PCR 技 术主要通过荧光染料来指示产物的增加。无论是探针类实时荧光 定量 PCR 技术还是非探针类实时荧光定量 PCR 技术，检测的都是 扩增产物的增加量。但探针类实时荧光定量 PCR 技术增加了识别 探针的具体的流程，操作的难度较大。
根据所使用的技术不同，实时荧光定量PCR可以分为：荧光探针和荧光染料两种方法。
现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的3'→5'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的shou选技术平台
2. SYBR荧光染料
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加wan全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。SYBR荧光染料法定量PCR的基本过程是：
① 开始反应，当SYBR染料与DNA双链结合时发出荧光；
② DNA变性时，SYBR染料释放出来，荧光急剧减少；
③ 在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR引物；
④ 聚合完成后，SYBR染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
实时荧光定量PCR技术根据化学原理可以分为探针类和非探针类。探针类实时荧光定量 PCR 技术主要是利用与靶序列特异杂 交的探针来指示扩增产物的增加；非探针类实时荧光定量 PCR 技 术主要通过荧光染料来指示产物的增加。无论是探针类实时荧光 定量 PCR 技术还是非探针类实时荧光定量 PCR 技术，检测的都是 扩增产物的增加量。但探针类实时荧光定量 PCR 技术增加了识别 探针的具体的流程，操作的难度较大。
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