酶联免疫吸附测定 （ELISA）过程中显色步骤及其注意事项
2025-05-28 来源:本站 点击次数:9
酶联免疫吸附测定 （ELISA）检测过程中的显色步骤是关键环节之一，涉及酶促反应和颜色变化以实现目标物质的定量或定性分析。
以下是显色步骤的具体过程：
加入显色底物：在检测抗体孵育结束后，移除孔中的液体并进行彻底洗涤，以去除未结合的物质。然后，向每个孔中加入显色底物，如TMB（四甲基联苯胺）或OPD（邻苯二胺）。这些底物在辣根过氧化物酶（HRP）的作用下被催化产生有色产物。
避光孵育：显色反应通常需要避光进行，以防止底物的光降解。TMB在HRP的作用下生成蓝色产物，而OPD生成橙黄色产物。反应的时间和温度会影响显色的强度和速度。
显色时间控制：在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应严格控制，以确保显色达到预期的平衡状态。例如，OPD底物显色在室温或37℃反应20-30分钟后基本完成，过长的反应时间可能导致本底值增高。TMB的显色约40分钟达，随后逐渐减弱，至2小时后可能消退至无色。
终止反应：显色达到预期后，加入终止液终止显色反应。对于TMB，常用硫酸作为终止液，显色由蓝色转向黄色。对于OPD，硫酸终止后显色由橙黄色转向棕黄色。终止反应后，颜色变化稳定，便于后续的吸光度测定。
比色测定：比色前，用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，并将酶标板正确放入酶标比色仪的比色架中。比色时，应先以蒸馏水校零点，然后测读底物孔和空白孔的吸光度，作为背景校正。比色结果通常在特定波长下读取，如TMB在450nm，OPD在492nm。
吸光度计算：将各孔的吸光度值减去空白孔的吸光度值，然后根据标准曲线或计算公式进行结果的定量或定性分析。 ELISA检测过程中的显色步骤是至关重要的，它直接关系到实验结果的准确性。显色通常发生在实验的最后阶段，通过酶催化底物生成有色产物来实现。这个过程需要
注意以下几个关键点：
底物的选择：常用的底物有TMB（四甲基联苯胺）和OPD（邻苯二胺）。TMB在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下生成蓝色产物，加入终止液后变为黄色，适用于比色检测。OPD则生成橙黄色产物，但其显色反应需避光进行。
显色条件：显色反应的温度和时间会影响显色的深浅。室温或37°C下进行显色，时间通常控制在20-30分钟，以确保显色达到理想状态而不过度。
终止反应：对于TMB底物，常用的终止液包括硫酸，它能将蓝色产物转变为黄色，便于在450nm波长下读取吸光度。OPD底物在显色后需要避光，并在一定时间后加入终止液。
显色时间的控制：显色时间过长可能导致背景升高，而过短则可能无法完全显色。通过观察阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况，适时终止反应。
显色均匀性：显色过程中应避免光照，因为某些底物如OPD在光照下会自行变色。确保显色反应在一个均匀、避光的环境中进行。
显色剂的保存：底物和终止液应避光保存，避免污染和氧化，确保显色反应的特异性。 通过精确控制上述条件，可以确保ELISA检测过程中的显色步骤达到预期效果，从而提高实验结果的准确性和可靠性。
以下是显色步骤的具体过程：
加入显色底物：在检测抗体孵育结束后，移除孔中的液体并进行彻底洗涤，以去除未结合的物质。然后，向每个孔中加入显色底物，如TMB（四甲基联苯胺）或OPD（邻苯二胺）。这些底物在辣根过氧化物酶（HRP）的作用下被催化产生有色产物。
避光孵育：显色反应通常需要避光进行，以防止底物的光降解。TMB在HRP的作用下生成蓝色产物，而OPD生成橙黄色产物。反应的时间和温度会影响显色的强度和速度。
显色时间控制：在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应严格控制，以确保显色达到预期的平衡状态。例如，OPD底物显色在室温或37℃反应20-30分钟后基本完成，过长的反应时间可能导致本底值增高。TMB的显色约40分钟达，随后逐渐减弱，至2小时后可能消退至无色。
终止反应：显色达到预期后，加入终止液终止显色反应。对于TMB，常用硫酸作为终止液，显色由蓝色转向黄色。对于OPD，硫酸终止后显色由橙黄色转向棕黄色。终止反应后，颜色变化稳定，便于后续的吸光度测定。
比色测定：比色前，用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，并将酶标板正确放入酶标比色仪的比色架中。比色时，应先以蒸馏水校零点，然后测读底物孔和空白孔的吸光度，作为背景校正。比色结果通常在特定波长下读取，如TMB在450nm，OPD在492nm。
吸光度计算：将各孔的吸光度值减去空白孔的吸光度值，然后根据标准曲线或计算公式进行结果的定量或定性分析。 ELISA检测过程中的显色步骤是至关重要的，它直接关系到实验结果的准确性。显色通常发生在实验的最后阶段，通过酶催化底物生成有色产物来实现。这个过程需要
注意以下几个关键点：
底物的选择：常用的底物有TMB（四甲基联苯胺）和OPD（邻苯二胺）。TMB在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下生成蓝色产物，加入终止液后变为黄色，适用于比色检测。OPD则生成橙黄色产物，但其显色反应需避光进行。
显色条件：显色反应的温度和时间会影响显色的深浅。室温或37°C下进行显色，时间通常控制在20-30分钟，以确保显色达到理想状态而不过度。
终止反应：对于TMB底物，常用的终止液包括硫酸，它能将蓝色产物转变为黄色，便于在450nm波长下读取吸光度。OPD底物在显色后需要避光，并在一定时间后加入终止液。
显色时间的控制：显色时间过长可能导致背景升高，而过短则可能无法完全显色。通过观察阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况，适时终止反应。
显色均匀性：显色过程中应避免光照，因为某些底物如OPD在光照下会自行变色。确保显色反应在一个均匀、避光的环境中进行。
显色剂的保存：底物和终止液应避光保存，避免污染和氧化，确保显色反应的特异性。 通过精确控制上述条件，可以确保ELISA检测过程中的显色步骤达到预期效果，从而提高实验结果的准确性和可靠性。
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